在斑馬魚以CRISPR/Cas9基因編輯方法建立ndr2突變之人類遺傳疾病模式

Abstract

Right atrial isomerism (RAI) 又稱兩側右心房症，屬於一種先天性心臟病，新生兒發生率大概約0.02~0.05%，如果不治療，致死率極高。一般的正常人心臟會有4個腔室，包含左右的心房和心室，但RAI的病患只有一個右心房和一個右心室，這會導致充氧血和缺氧血無法阻隔且混合，血氧濃度偏低，出現發紺的缺氧現象。發生的主因是因為在胚胎形成時，控制左右器官分化的基因突變，導致身體無法正常分化，變成兩邊都是右邊的器官，且常合併無脾症。 我們在RAI患者抽血，然後把血液樣本拿去做NGS次世代定序，結果發現Nodal基因有突變發生，307位置的精胺酸 (Arginine) 發生missense變成麩醯胺酸 (Glutamine) (R307Q)。Nodal基因是TGFβ家族的一員，位於10號染色體上，與早期胚胎的發育相關，在人類中，Nodal的突變可能導致異位綜合症 (Heterotaxy)。在斑馬魚中可分為ndr1 (squint mutant) 和ndr2 (cyclops mutant)，此實驗是將一段突變的序列－ndr2 (R307Q)，以及Crystallin眼睛促進子，附帶綠色的螢光標記蛋白的質體，利用CRISPR/Cas9的方式進行斑馬魚轉殖實驗，爾後觀察斑馬魚的心臟發育。 CRISPR/Cas9是一種細菌遭噬菌體入侵的防禦機制，後來被應用於基因編輯技術上，在此CRISPR/Cas9系統，我們使用了Cas9 D10A Nickase，並提供兩條guide RNA (gRNA)，透過double nicking的方法進行基因編輯，藉此降低脫靶效應(off-target effects)。 首先在in vitro實驗，測試gRNA-58號和gRNA-71號以及Cas9 Nuclease，是否能將pGEMT-R307R-1st (ScaI線性化) 和pGEMT-R307Q-1st (ScaI線性化) 和BS-L-oligo-ndr2-exon2-intro2-exon3-R307R-Hu-Cr-IRES-GFP-3'-UTR-R-oligo-1st質體 (XhoI和EcoRI線性化) 切斷。結果顯示，gRNA-58號都會切所有測試的。但是，兩個核苷酸突變 (R307Q) 之後，gRNA-71號依然會辨識R307Q，且切斷DNA，表示有脫靶效應(off-target effects)。 由於上述的效應，我們在兩個gRNA對應的位置進行多點核甘酸序列的突變 (wobble mutation)，避免脫靶效應，得到pGEMT-R307R-2nd和pGEMT-R307Q-2nd，這兩個質體，測試結果都不會被gRNA-58號和gRNA-71號所辨識，因此可進行後續in vivo的顯微注射實驗。 在in vivo的實驗，以顯微注射的方式將兩個gRNA、Cas9 D10A Nickase、donor DNA打進一個細胞期的斑馬魚受精卵，爾後進行觀察。在F0第四天的胚胎中，觀察到綠色的螢光蛋白在神經管、neuromast、floor plate以及尾巴區域零星表現。經過篩選，F1的穩定品系中，在第五天時，觀察到綠色的螢光蛋白在神經細胞、floor plate、neuromast零星表現。F1綠色螢光表現的位置，是否對應ndr2基因表現的位置，有待釐清。