利用CRISPR-Cas9系統產製Pax4基因剔除之第一型糖尿病小鼠

Abstract

糖尿病為近年來相當常見的慢性代謝性疾病，造成患者眾多不適，並威脅到患者壽命。國際糖尿病聯合會於2021年的報告中，全球有約5.37億糖尿病患者，臺灣則有245萬人患有糖尿病，占總人口約9.7%。第一型糖尿病為慢性自體免疫性疾病，因免疫反應導致患者缺乏β細胞，其對患者之影響不容忽視，而在相關研究中發現Pax4基因的變異與第一型糖尿病的風險有關。而Pax4基因對於胚胎發育中之胰臟β細胞分化作用有重大影響，若失去功能則會造成β細胞缺失，與第一型糖尿病相似。CRISPR-Cas9系統為近年經常被使用的工具，可對目標序列進行辨識並造成雙股斷裂，引發修復機制進而造成缺失突變或修改為特定序列。本試驗欲使用CRISPR-Cas9系統對於小鼠的Pax4基因進行剔除，使其失去功能並影響β細胞分化，藉此模擬第一型糖尿病患者胰島中缺乏β細胞的現象。體外試驗部分，將可表現sgRNA與Cas9的質體轉染至細胞株中，並以流式細胞儀分選成功轉染之細胞，而後檢測不同組別sgRNA的編輯作用效率，結果於體外試驗中挑選出兩組效率較高的sgRNA。體內試驗部分，將兩組sgRNA及Cas9蛋白以顯微注射的方式送入一細胞期的小鼠胚中，並進行胚移置，合計產下155隻小鼠，後續分析結果顯示其中100隻小鼠的基因組出現編輯現象；在DNA序列定序結果中發現部分小鼠出現大片段序列剔除的現象；而在小鼠表現性狀中發現Pax4-/-小鼠出現生長表現異常的現象，並與野生型及Pax+/-小鼠有顯著差異(出生48小時體重，Pax4-/-：1.44±0.24g；Pax4+/-：2.46±0.41g；野生型：2.31±0.31g) (a=0.05) ;同時在血糖數值方面也顯著高於其他兩種基因型小鼠(出生後60小時，Pax4-/-：538.24±65.00 mg/dl；Pax4+/-：103.20±20.61 mg/dl；野生型：96.57±12.12mg/dl) (a=0.01)。為探究造成此差異的原因，進一步執行胰臟組織切片染色及免疫螢光染色，結果發現Pax4-/-小鼠胰島出現型態改變的情形，並且其胰島並無分泌胰島素之現象，由此推論在Pax4基因受到突變後確實影響到β細胞的分化，導致小鼠無法正常分泌胰島素，進而影響生長並處於高血糖的狀態。本試驗藉由CRISPR-Cas9系統成功編輯小鼠之Pax4基因，使其序列產生突變並失去功能，使Pax4-/-小鼠出現體重降低以及高血糖的狀態，並得知原因為與第一型糖尿病相似之胰島中缺乏β細胞的現象。希望以此Pax4基因編輯小鼠模擬第一型糖尿病以作為其模式動物，並可作為未來研究者欲進行相關研究的動物材料，以增進對第一型糖尿病之相關研究。