利用Kluyveromyces marxianus建立蛋白質表現系統應用於siamenoside I 之轉換

Abstract

近年來非模式生物酵母菌如 Kluyveromyces marxianus，因具有高分泌蛋白的特性（high secretory capacity）、耐高溫及利用各種不同碳源的能力而被廣泛用於發酵工業上。然而，K. marxianus 之同源重組效率低，所以在利用傳統基因工程技術上有一定的困難。因此本實驗以 CRISPR/Cas9 基因編輯技術進行 K. marxianus 菌株之蛋白質表現系統的建立，應用於羅漢果皂苷的轉換。首先，將 K. marxianus 菌株中指定的 β-glucosidase基因（EXG1）剔除並嵌入目標基因（DbEXG1），使其菌株在發酵時具有能力將羅漢果皂苷 mogroside V水解成具有高甜度的 siamenoside I 。結果顯示，菌株在 KmEXG1基因剔除後喪失了水解羅漢果皂苷的能力而嵌入目標基因的菌株則能夠穩定表現 DbExg1 蛋白。為增加 DbExg1蛋白的產量，分別利用不同啟動子序列評估 K. marxianus 及 S. cerevisiae 菌株在大量表現 DbExg1蛋白的能力。出乎預料的是，當菌株利用 S. cerevisiae 的GAP 啟動子序列時（ScGAP），只需要發酵 24小時就能夠將 mogroside V 完全轉換成 siamenoside I。然而，當利用 K. marxianus 的 GAP 啟動子序列（KmGAP）則需要發酵超過72小時。這顯示 S. cerevisiae 菌株在 siamenoside I 皂苷轉換的效率相較基因改造後的 K. marxianus 較好。雖然 K. marxianus 較 S. cerevisiae 具有外泌大量總蛋白的能力，分別在使用 ScGAP 啟動子序列為 （0.68 ± 0.02 mg/mL 及 0.51 ± 0.01 mg/mL，p ˂ 0.05）而在使用 KmGAP 啟動子序列分別為（0.55 ± 0.02 mg/mL 及 0.27 ± 0.02 mg/mL，p ˂ 0.05）。但以 Western Blotting 分析發現 K. marxianus 對 DbExg1的外泌量卻較 S. cerevisiae 少，而 S. cerevisiae 在使用任一種類的 GAP 啟動子相較 K. marxianus 都具有能力外泌較多的 DbExg1 蛋白。因此，S. cerevisiae BY4741 系列在 siamenoside I 皂苷轉換有較好的能力。 未來可利用不同種類的 K. marxianus 進一步測試並評估其菌株在建立大量表現外源性蛋白之系統的可行性。