羅勒毛狀根中迷迭香酸合成酶之RNAi基因沉默之研究

Abstract

"植物次級代謝物是來自植物的小分子有機化合物，用於調和植物與環境的相互作用。植物次級代謝物同時在現代醫學中為重要的藥物，常作為癌症藥物等各種疾病藥物之先導化合物 (lead compounds)。其中，鬼臼素 (podophyllotoxin) 之衍生物能用於治療肺癌等多種癌症之化療藥物etoposide和teniposide。但鬼臼屬的植物生長緩慢且次級代謝物的產量不多，同時化學結構複雜，很難使用化學合成方法大量合成產物。因此本研究之目的為透過代謝工程之方法建構能生合成鬼臼素前驅物 (precursor) 之羅勒 (Ocimum basilicum)。目標基因為迷迭香酸合成酶 (Rosmarinic acid synthase, RAS)，一種催化4-Coumaroyl-coA和4-hydroxyphenyllactate合成迷迭香酸之酵素。透過RNA干擾 (RNA interference, RNAi) 的技術，下調羅勒中迷迭香酸 (rosmarinic acid) 的生合成，驅使代謝路徑上之前驅物走向生合成鬼臼素之路徑。將建構好的抑制RAS表現之質體pRASi轉形進根毛農桿菌 (Agrobacterium rhizogenes) ATCC15834中，並感染羅勒誘導RNAi毛狀根產生，同時用未帶有pRASi之農桿菌ATCC15834誘導的毛狀根做為控制組。挑選生長狀況好且側根多的毛狀根進行培養，獲得未進行RNAi之毛狀根HR5和HR12，以及具RNAi表現之毛狀根RASi21和RASi22。之後，以real-time PCR檢測RASi21和RASi22的RAS表現量，結果發現其RAS基因表現量較HR5和HR12顯著下降。再以UPLC測量目標產物迷迭香酸的累積量，顯示兩週大之RASi21和RASi22的迷迭香酸累積量最少僅有0.9983 mg/g DW，比起兩週大之HR5和HR12有到20.94 mg/g DW顯著降低。成功獲得經過RNAi之技術進行RAS基因沉默後的毛狀根RASi21和RASi22。此外，經過多種羅勒毛狀根再生 (regeneration) 之培養基嘗試，發現較適合添加之植物激素比例，未來有望將RASi21和RASi22再生為完整植株，以用於進一步的毛狀根誘導。再經由轉形鬼臼素生合成路徑上之基因進羅勒，以生產抗癌植物次級代謝物。"