Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 PSPTO_3482 基因操作組之特性分析

Abstract

"革蘭氏陰性細菌可以利用第六型分泌系統 (type VI secretion system, T6SS) 將效應蛋白運送到真核或原核細胞中，參與在其致病力、養分獲取或細菌間的競爭之中。實驗室之前的研究中發現，模式植物病原細菌 Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000具有 HSI-I和 HSI-II 兩套第六型分泌系統基因叢集 (gene cluster)；此外，為了找到由特定 VgrG 攜帶的效應蛋白，搜尋到基因體序列中帶有七個 vgrG 同源基因，且從 vgrG3 啟動子的高表現量推測其可能在Pst DC3000的生理活性上具有功能。因此本研究便從第六型分泌系統的角度切入，針對 VgrG3 操作組 (operon) 上的基因進行深入的探討，以了解 VgrG3 對Pst DC3000的重要性。透過生物資訊學分析，VgrG3 座落於一由PSPTO_3482-3485四個基因所組成的操作組之中，除了 PSPTO_3482的基因產物被預測為VgrG 之外，其下游的 PSPTO_3483產物為帶有DUF4123結構域的蛋白質，PSPTO_3485推測為具有 lipase 活性的效應蛋白，而 PSPTO_3484 無特殊結構域，但根據其位於 vgrG 操作組中且位於可能為效應蛋白的 PSPTO_3485 上游，故推測其可能為 PSPTO_3485 之免疫蛋白。利用半定量反轉錄聚合酶連鎖反應確定了各基因在不同醣類培養基中培養時均會表現但表現量會有不同。透過競爭試驗發現，PSPTO_3485突變株抑制 P. savastanoi pv. phaseolicola (Psph) 1448a 及 Escherichia coli MG1655 生長的能力下降，且此現象為 contact-dependent；而缺失PSPTO_3482、PSPTO_3483 與 PSPTO_3484也同樣會影響Pst DC3000對此二菌的競爭現象。將PSPTO_3485表達在Psph 1448a 及 E. coli MG1655 細胞質中，並不會對細菌生長造成影響；但如果透過加上 signal peptide 使其表達於 E. coli BL21(DE3) 的周質時，會發現 E. coli 生長被抑制，但同時表達 PSPTO_3484和 PSPTO_3485 可以緩減 PSPTO_3485 對 E. coli BL21(DE3) 的毒性。此外，若在 Psph 1448a 中表現 PSPTO_3484 時，可以緩減 Pst DC3000 對其造成的生長抑制。本研究結果顯示 PSPTO_3485 在 Pst DC3000 與其他細菌的競爭作用上是重要的，且其作用位點應該是在目標細胞的周質中；PSPTO_3484 的出現則具有保護作用，推測其可能具有免疫蛋白的功能。但由於無法確認 PSPTO_3485 是否會分泌至胞外，故尚無法確認其為 Pst DC3000 第六型分泌系統的效應蛋白。"