利用細胞生物學策略分析 HC-Pro 如何作用並干擾重要核酸靜默反應元件之研究

Abstract

Potyvirus 的基因靜默抑制子 HC-Pro 在抑制轉錄後基因靜默作用 (PTGS) 中起著重要的作用。然而，目前對於HC-Pro如何抑制微型核酸 (miRNA) 甲基化與 ARGONAUTE 1 (AGO1) 的加载以形成 RISC複合體 (RISC)的作用途徑尚未清楚。我们先前的研究表明HC-Pro 利用自噬途徑中的相關蛋白ATG8a介導降解ARGONAUTE1 (AGO1) 蛋白並抑制HEN1甲基轉移酶活性。本研究利用蛋白的螢光共位 (colocalization) 和福斯特能量共振轉移 (FRET) 研究in vivo細胞內蛋白質與蛋白質相互作用。我們的結果顯示 HC-Pro 与 AGO1 在Suppression body (S-body) 有間接相互作用。另外HC-Pro 和 ATG8a 有colocalization現象和相互作用，再次證明ATG8a 與HC-Pro 間接誘導 AGO1 降解有關。FRET 結果也顯示HC-Pro直接物理相互作用抑制 HEN1 甲基轉移酶活性，而未甲基化的微型核酸 (unMet-miRNA) 無法加載至 RISC 复合體。除此之外，HC-Pro 與Processing body (P-body) 標記物的mRNA-去頭蓋蛋白質2 (DCP2)有colocalization現象和相互作用。實驗結果顯示HC-Pro 在細胞質形成S-body。根據PTGS 分子如AGO1、HEN1、ATG8a 和 DCP2 的焦距大小結果，我們推測S-body會吸引這些蛋白進入。了解 S-body 和 PTGS 分子之間的關係讓我们更加理解 HC-Pro 如何抑制微型核酸途徑，并確認微型核酸被甲基化與加載到 AGO1 的位置。這些研究可闡明HEN1 如何喪失甲基化活性。進一步的研究可以顯示未甲基化的微型核酸如何誘導ATG8a自噬蛋白介導 AGO1 降解。綜合來說，這項研究有助于理解 PTGS 調控與植物和病毒之間的相互作用。