透過親和力富集質譜平台比較大腸桿菌中肽聚醣合成複合物的相互作用組分析

Abstract

"肽聚醣 (peptidoglycan, PG) 細胞壁是所有細菌中必不可少的重要組成部分，其合成是通過動態或是瞬時的多蛋白複合物進行的。革蘭氏陰性菌之大腸桿菌(Escherichia coli)具有獨特的 PG 合成複合物，包括延長體、分裂體和兩種 A 類的青黴素結合蛋白（penicillin binding proteins, PBPs）。這些生化實體催化基本相同的反應，近期的研究已經確定它們的特殊功能，主要是基於波動的環境條件下，對其突變表型的分析。儘管 PG 合成複合物重要的動態特性已被廣泛接受，但尚未有系統地研究複合物與主成分之間的相互作用。在這裡，我們開發了一種強親和力的富集質譜實驗平台，將複合物保留在其天然的膜結合環境中，且 PG 合成複合物 PBP1a、PBP1b、PBP2、MreB和 FtsZ 分別與弱/瞬態夥伴進行結合。為了將複合物保留在其天然條件下，我們設計大腸桿菌菌株，透過內源性表達之誘餌蛋白和親和標籤相融合。將化學交聯劑應用於活細菌樣品和蛋白質之間的交聯作用，並使用苯乙烯馬來酸 (SMA) 在膜結合的天然環境中提取蛋白質複合物。純化的複合物用於質譜分析以進行蛋白質鑑定。我們在上述五種誘餌蛋白的相互作用組中鑑定了 971 個獨特的結合夥伴。豐富的功能性分析允許識別其不同功能間的關聯性。用定量數據集探索其誘餌蛋白的相對特異性，並確定其潛在的誘餌特異性蛋白之相互作用物。此處介紹的主要 PG 合成和調節蛋白間的相互作用組，並針對功能冗餘蛋白提供獨特的見解，作為其保守且實質重要的細菌系統中不同的相互作用組模塊的藍圖。 "