東方果實蠅對合成除蟲菊酯之抗性機制探討

Abstract

東方果實蠅 (oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae)) 是台灣重要的果樹害蟲之一，已知為害的寄主植物超過 150 種。合成除蟲菊酯於 2000 年登記為防治東方果實蠅用藥，其作用機制是轉變電壓閥門鈉離子通道 (voltage-gated sodium channel, VGSC) 的構形，並對昆蟲具有擊昏 (knock down) 的作用。Hsu 於室內篩選東方果實蠅抗性品系實驗得知，合成除蟲菊酯產生抗藥性的速度極快，且抗性程度也非常高，因此必須藉著了解東方果實蠅對合成除蟲菊酯的抗性機制，才能有效控管合成除蟲菊酯的抗藥性發生。本論文所使用的東方果實蠅合成除蟲菊酯抗性品系分別為賽滅寧 (cypermethrin (cyp-r))、賽扶寧 (cyfluthrin (cyf-r))、芬化利 (fenvalerate (fenv-r)) 抗性品系以及感性品系。利用局部滴加法測試各個抗性品系對非篩選之合成除蟲菊酯的交互抗性，我們發現所有的抗性品系皆對賽扶寧產生非常高的交互抗性 (cyp-r：62.9 倍；fenv-r：154 倍)，而對賽滅寧與芬化利的交互抗性程度則相對較低。我們以合成除蟲菊酯檢測 cyp-r、cyf-r 與 fenv-r 被擊昏與回復情形，發現cyp-r 與 cyf-r 皆在 30 分鐘內全部昏厥，fenv-r 則約 4 小時才全部昏厥；如事先加上協力劑 PBO 的處理，則會增加抗性品系的被擊昏速度，尤其在 fenv-r 最為明顯；在回復情形部分，發現抗性品系的回復情形略高於感性品系，而 PBO 處理後的所有品系皆無感受性回復之情況產生。利用 PBO、TPP 及 DEM 等協力劑測試對合成除蟲菊酯的協力效果 (synergism)，發現 PBO 不僅在感性品系中有良好的協力效果 (賽滅寧：7.7 倍；賽扶寧：12.1 倍：芬化利：10.4 倍)，且在抗性品系中產生更佳的效果 (cyp-r：26.3 倍；cyf-r：55.6 倍；fenv-r：50.7 倍)。利用不同受質分別測試酯酶 (esterases)、多功能氧化酶、穀胱甘肽硫基轉移酶 (glutathione S-transferases) 的酵素活性，酯酶活性於抗性品系中並沒有顯著提高；利用受質 7-ethoxycoumarin 測試氧化酶活性，cyp-r (3.94 倍) 與 fenv-r (2.31 倍) 顯著高於感性品系，而受質 methoxyresorufrin 則皆無顯著差異。更進一步的利用 Quantitative realtime PCR 去測試 fenv-r 的多功能氧化酶基因，發現 4 個 CYP6 及 1 個 CYP4 家族的氧化酶基因表現量為感性品系的 5 倍以上。在標的作用機制部分，感性品系的除蟲菊酯標的部位電壓閥門鈉離子通道 (Voltage-gated sodium channel, VGSC)已定序完成，序列長度為 6498 個鹼基對，並且比對芬化利抗性品系與感性品系的 VGSC 序列，我們在抗性品系 5 隻個體中發現 R52Q、K437R、V531A、V531T、E1168K、S1449A、S1449T、M1640V、M1640T、V1755I、I1876N 及 D1943G 等胺基酸的變異。由協力劑、酵素活性實驗以及多功能氧化酶基因表現量的分析，我們可以知道多功能氧化酶確實在合成除蟲菊酯抗性品系中，擔任非常重要的角色；標的不敏感抗性方面，雖然我們發現許多只出現在抗性品系中的胺基酸變異，但與目前發表的 kdr 點突變位置並不重疊，而且這些胺基酸變異僅有 I1876N 出現的頻率較高 (4/5)。因此，我們認為室內所篩選出的東方果實蠅合成除蟲菊酯抗性品系的主要機制為多功能氧化酶，而 VGSC 上的胺基酸變異之貢獻仍需更進一步研究。