復性緩衝液中氧化還原對之變化及其對溶菌酶復性效果之影響

Abstract

無論在工業上或學術研究上，對於蛋白質復性程序中，如何在高濃度蛋白質下，提高復性產率為主要課題。直接稀釋法為最簡便之復性方法，而藉由氧化還原對濃度的改變、添加劑的加入以及物理方法上的應用皆有效的提升蛋白質復性效果。 本研究針對復性緩衝液中還原態穀胱甘肽(reduced glutathione,GSH)濃度變化作分析，探討不同操作條件下所造成的影響，最後將所得濃度變化以動力學分析，期望得到一合適之反應方程式。同時將復性緩衝液隨時間放置，測量其對活性回收率之影響，討論氧化還原對(GSH/GSSG)濃度及比例在復性程序中的效果。我們使用高效能液相層析儀 (HPLC)將GSH濃度變化作分析，結果顯示在高溫環境下(50℃∼90℃)，GSH於反應後期均會產生副產物，而在低溫環境下(20℃∼40℃)，GSH則隨時間氧化成GSSG。利用動力學分析不添加EDTA時，GSH氧化速率為一0.5級反應；而添加EDTA則有效的延遲其氧化速率，為一1 級反應。在溶菌酶復性過程中，復性緩衝液隨時間放置，由於GSH氧化形成GSSG，復性效果亦隨時間增加。將GSSG濃度變化對活性回收率做圖以及GSSG/GSH比例對活性回收率做圖比較下可發現，GSSG濃度與活性回收率之間有正相關；而GSSG/GSH並非影響復性效果之絕對因素。且在GSSG濃度達1.2mM 以上時，有最好的活性回收率。