利用單分子螢光共振能量轉移實驗分析Cdc13與端粒結合之模式

Abstract

端粒在維持真核生物染色體完整性上扮演重要角色。Cdc13為單股TG1–3端粒DNA結合蛋白，在Saccharomyces cerevisiae中主要以二聚體形式存在，此外，Cdc13與Stn1、Ten1形成CST複合物並結合在端粒末端，可保護端粒DNA序列及調控端粒酶之活性；在傳統生化分析與蛋白結構分析中均顯示Cdc13可特異性地與端粒DNA進行交互作用，然而與端粒穩定結合之Cdc13實際上是如何坐落至端粒DNA上，並和其他蛋白進行「動態」交互作用的，直至今日都還尚未明瞭，因此我們利用單分子螢光共振能量轉移(smFRET)實驗，以觀察Cdc13和端粒DNA間之交互作用。結果顯示，Cdc13與TG12單尾雙股DNA受質結合後，會降低DNA受質之螢光能量轉移效率至兩個不同的數值，即兩種FRET state。除此之外，進一步利用Cdc13-dimer mutant與DNA-binding domain (DBD) mutant蛋白進行實驗，可得知此兩種FRET state分別為Cdc13 monomer和dimer結合至端粒DNA上所造成，且利用即時影像實驗進行動力學分析可發現monomer結合速率較dimer結合速率快。依據實驗結果可建立一初步之Cdc13結合端粒DNA結合模型， Cdc13 以monomer形式優先結合至單股端粒DNA，第二個monomer則接續加入並形成dimer。為了區分Cdc13 monomer和dimer結合模式是否具有相異的生物功能，我們進一步使用smFRET觀察Cdc13與Stn1或Cdc13、Stn1與Ten1間之交互作用。結果表明，Stn1並不會影響Cdc13結合端粒DNA能力，然而CST複合物可能輕微減弱Cdc13和DNA間之親和力。綜合上述，本篇研究透過一單分子實驗建立了一個較為詳細的Cdc13結合酵母菌端粒DNA模式。