利用生物工程改造益生大腸桿菌作為CRISPR合成與傳遞之基因編輯系統

Abstract

"基因編輯系統CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated Proteins)能夠精準且有效的編輯基因組，提供未來治療疾病與細胞編輯的新方向。然而截至目前，基因編輯系統仍缺乏適當與安全的傳輸方式將CRISPR/Cas傳輸至宿主體內。常用的病毒相關CRISPR載體有外源基因隨機插入宿主基因體的風險，並且無法長期控制Cas內切脢表達量，易造成脫靶效應; 另一個方式則是直接遞送已組裝之CRISPR 核酸蛋白質至宿主體內，雖然限制蛋白質總量使其較具安全性，但組裝之CRISPR藥物難以脫離細胞之胞內體 (endosome)，導致載體運送CIRSPR藥物仍為一道難題。為了改善目前傳遞蛋白質的困境，本研究欲透過合成生物學，編輯益生菌作為一種CRISPR 核酸蛋白質之傳遞系統，除了可在益生菌內高效率的生產、組裝CRISPR核酸蛋白質，同時益生菌本身也被改造為具有保護、傳輸功能的載體。 具體來說，我們以合成生物學改造probiotic E. coli Nissle 1917 (EcN) 表達誘發細胞胞吞的invasin與脫離胞內體的listeriolysin O (LLO) ，藉以釋放細菌表達的CRISPR 核酸蛋白質進入細胞質，接著核酸蛋白質藉由核定位序列 (nucleus localization signal, NLS) 的輔助進入細胞核中編輯基因 (knockout)。目前，本研究證實EcN運輸系統可透過invasin與LLO將螢光蛋白質送入細胞的細胞質中; 同時EcN組裝之核酸蛋白質具有in vitro 與 in vivo基因剪輯能力，亦即我們以HCT116-EGFP做為剔除細胞基因模式，以EcN傳輸系統傳遞CRISPR 核酸蛋白質剔除細胞內EGFP基因之後，觀察到HCT116細胞族群的GFP螢光細胞數量降低，表達證實EcN可傳遞CRISPR 核酸蛋白質進行編輯基因。期望此系統未來可做為一種經濟、安全、有效的蛋白質傳輸載體，並提供基因編輯新的應用方式。"