探討尿道致病性奇異變形桿菌之抗銅機制-銅結合蛋白質CueR抗銅及調控毒力因子之研究

Abstract

奇異變形桿菌(P. mirabilis)為人體一重要的尿道致病菌，其常引發尿導管相關的尿道感染。當尿道感染發生時人體為抵禦病菌的入侵會提升尿液中的銅濃度，其中P. mirabilis所引發的UTI可使尿液中銅濃度上升至約0.5 μM，同時清除外來致病菌的巨噬細胞中銅濃度會提升至約500 μM來加强對致病菌的毒殺作用。過量的銅會對菌體造成傷害，故細菌會啓動抗銅機制來維持菌體内銅濃度之恆定。目前對P. mirabilis的抗銅機制所知甚少，故本篇欲探究P. mirabilis的抗銅機制。 首先利用跳躍子突變法從約15000株突變株中篩選得到5株對銅感受性提高之突變株，經過基因分析後得到cueR突變株及copA突變株；同時以blast方式來尋找P. mirabilis中存在的抗銅基因，並結合實驗室之前transcriptome之結果推測出Cue系統於P. mirabilis的抗銅機制中扮演著重要作用。於是利用reporter assay及qPCR確認了P. mirabilis之CueR可正向調控抗銅相關基因cueO、 copA及copG之表達，而AAS之結果亦印證CueR可幫助菌體維持菌體内之銅濃度恆定。 接著探究CueR在0.5 μM及500 μM這兩個已知的生理銅濃度下對菌體毒力因子之影響，本篇結果表明無銅或0.5 μM銅離子環境并不影響cueR突變株生長狀況及細胞外毒力因子之表達，但於500 μM 銅離子環境下，cueR突變株相較於野生株之生長狀況、尿素酶活性、生物膜形成能力、表面移行能力及泳動能力皆顯著下降，由reporter及qPCR之分析可知cueR突變株因鞭毛形成相關基因flhDC的轉錄及fimbriae中與感染力相關之基因mrpA、pmfA、fim14、pmpA之表現量顯著下降，進而造成其運動性及細胞黏附能力下降。而在預處理銅後其抗氧化能力及巨噬細胞内存活率顯著上升可能與scsA表現量增加有關，但在未預先處理銅時cueR突變株之抗氧化能力及巨噬細胞内存活率則顯著低於野生株，同時小鼠實驗亦證實cueR突變株於小鼠膀胱及腎臟中的定植能力均顯著下降。 綜上可知於銅環境下CueR不僅可正向調節cueO、copA及copG之基因表達來維持菌體内銅濃度水平，亦可影響尿素酶活性、運動力、生物膜形成能力、上皮細胞黏附能力、巨噬細胞内存活能力及其定植能力等多種毒力因子。因此CueR在P. mirabilis之抵抗銅壓力及維持毒力因子中均扮演著重要角色。