探討σ因子 RpoN的 兩個增強子結合蛋白FhlA以及QseF在奇異變形桿菌中所扮演的角色

Abstract

"奇異變型桿菌 (Proteus mirabilis)是主要造成泌尿道感染 (urinary tract infection, UTI)的病原菌之一，在長期使用尿導管的患者，容易造成伺機性感染。細菌為了適應環境，必須快速改變基因組表現， alternative sigma factors的功能便是因應外來環境變化，將轉錄組重新定向 (redirection)。RpoN為alternative sigma factors的一員，常與移動性、生物膜和尿素酶等細菌毒性因子相關，需要特定的enhancer binding proteins (EBPs)進行活化後，始能啟動轉錄。透過BLAST分析P. mirabilis N2 genome找出4個可能EBPs FhlA, QseF, PspF與NtrC，並挑選fhlA與qseF突變株分析重要毒性因子如尿素酶活性、移動性以及生物膜形成能力等。在尿素酶活性的部分，rpoN與fhlA突變株尿素酶活性顯著低於野生株；移動性的部分，rpoN及qseF突變株表面移行能力較野生株差；而生物膜形成能力上相較於野生株，qseF突變株則顯著低於野生株，而rpoN突變株則沒有明顯差異。 FhlA為formate hydrogenlyase (FHL)activator，擁有GAF domain來感受外界因子，可以活化的下游基因fdhF及hyf operon表現並形成FHL complex，FHL complex可以將生長環境去酸化。我們發現P. mirabilis N2尿素酶活性隨著pH值增加而增加，在pH9的時候達到最佳活性，因此我們假設FHL會協同尿素酶將環境去酸化，而使得尿素酶活性增加，實驗顯示隨著環境pH值增加到pH 9，hyfG及fhlA失去調控尿素酶活性的能力，而將野生株及hyfG突變株培養在pH 5人工尿中，發現hyf突變株去酸化的速度顯著低於野生株。我們利用人工尿模擬尿液環境，測試尿結石形成能力，可以看到hyfG及fhlA突變株尿結石形成能力顯著低於野生株。利用ICR母鼠泌尿道感染模型進行試驗，不論在膀胱或腎臟hyfG及fhlA突變株定殖能力皆顯著下降。 QseF為雙組成系統QseEF的response regulator，我們進行小鼠泌尿道感染試驗，發現qseF突變株定殖能力不論在膀胱或腎臟皆顯著低於野生株。 QseF正向調控glmY (sRNA)、flhDC (鞭毛調控轉錄因子)、cheA (化學趨化蛋白)以及負向調控rcsB (轉錄因子)等基因表現，其中QseF正向調控glmY基因轉錄，而GlmY可以直接與cheA mRNA作用，調控cheA的轉譯，進一步影響細菌移動性。 我們看到QseF正向調控glmZ及rpoS表現，而先前實驗室發現GlmZ透過正向調控rpoS表現可以幫助細菌抵抗酸性與氧化壓力環境，增加在巨噬細胞存活率，此外相對於野生株，qseEGF以及glmZ突變株對膀胱細胞侵入能力顯著下降。在本文我們也發現溶血素基因hpmAB表現量在qseF突變株中降低，同時qseF突變株對於膀胱細胞毒性也顯著低於野生株。 除了移動性、壓力抗性以及細胞毒性之外，QseF同時調控了生物膜的形成，利用螢光顯微鏡可以觀察到24小時qseF突變株生物膜呈網狀分布，而野生株則能聚集發展。我們將時間細分為2小時一個單位，監測生物膜形成的量，可以發現在8小時之前(含)，qseF突變株生物膜形成量大於野生株，而10小時開始qseF突變株生物膜量維持不變而野生株持續增加，以至於24小時顯著低於野生株。RNA-seq資料及qPCR確認，可以看到zapABCD蛋白酶相關基因在qseF突變株中較野生株下降，並利用qPCR發現QseF在24h時正向調控sRNA RyhB3、RprA以及alternative sigma factor RpoE，先前文獻顯示P. mirabilis生物膜相關纖毛MR/P受RpoE調控，在qPCR中發現RyhB3正向調控zapA, rpoE以及mrpA；RprA則正向調控mrpA。我們測試生物膜相關因子發現qseF突變株自聚集及細胞貼附能力較野生株上升，而僅有蛋白酶活性下降，因此我們認為蛋白酶為生物膜發展所必需，影響生物膜繼續發展，而受RpoE調控的MR/P纖毛在排除自聚集以及細胞貼附能力之外，仍然為生物膜生成之重要因子。 本研究我們發現了RpoN相關EBPs FhlA及QseF能調控移動性、尿素酶活性、生物膜形成能力等重要致病因子，我們推論一、在開始形成extracellular cluster時RpoN-FhlA調控FHL表現並與尿素酶協同作用，加速環境去酸化使礦物質結晶沉積，進一步形成感染性尿結石及生物膜。二、在細菌懸浮時QseF受尿素及油酸(oleic acid)抑制，使得纖毛表現上升，鞭毛表現下降，一方面增加細菌貼附細胞能力，另一方面減少鞭毛抗原躲避宿主免疫反應；三、在遇到固態表面時，油酸則從負向調控轉為正向調控QseF，QseF正向調控細菌移動性，使P. mirabilis可以上行感染、促進細菌侵入宿主細胞，躲避免疫反應、增加細胞毒性，以獲取更多養分、增加細菌壓力抗性，以提高被巨噬細胞吞噬後的存活率。綜合上述，P. mirabilis利用FhlA及QseF進行整體轉錄組的調控，使細菌可以迅速改變其轉錄組，以利在環境多變的泌尿道感染中生存。 "