精子載體 探討以魚類精子作為傳遞外來基因的媒介

Abstract

利用電破法作為魚類基因轉殖到受精卵或胚胎的方式已被廣泛使用，但為了達到快速，大量及高轉殖效率的目的，精子載體攜帶外來基因，不失為良好的方式．本研究中利用 3 種帶有不同基因構築的質體，經由電破法轉殖入泥鰍精子，並分析轉殖後小魚的染色體。 結果顯示， ( l ）電破溶液方面：在精子活力及孵化率上，生理食鹽水為佳，且較 PBS 林格氏液或加鈣溶液接近控制組． ( 2 ）電破使用的 DNA 型式：轉殖 circular 與 linear 型式 pOPAFP-2000CAT ，經 Dot blot 分析，以 circular ( 50 % ）高於 linear ( 20 % ）。（3）電壓對魚苗孵化率及畸形率的關係：電壓由 8KV 降到 3.5KV 以下，其孵化率及畸形率分別為 13 % , 20 % （8KV）； 28 % , 0.05 %（3.5KV）電壓與孵化率為負相關與畸形率為正相關性（ 4 ）電破條件與活存率關係：改變電壓或其他參數，對於電破處理後所得到 2 cell stage 胚胎比例之間並無顯著差異（5）DNA 的存在與孵化率的關係：在 8KV 下， DNA 的有無，其孵化率相差一倍 ；3.5KV 下，則無差別（6）DNA 濃度的影響：使用 pOP5MGH2175 μg/ml 轉殖率為 43.3 ％高於 100μg/ml組的 28.5 ％而 DNA 濃度高於 25μg/ml，其孵化率 15.3 % ，控制組為 28.6 % ，此濃度下孵化率較低且與其他各組有顯著差異。(7)轉殖不同分子量質體及 cycle 數的影響：使用 pUC19 質體，並從 8cycle增加到 12 cycle ，其轉殖率由 40 ％提昇到 60 % ( 8 ）電破過程對 DNA 結構及轉殖後 Southern blot 的分析：電破 circular DNA ，電泳分析上層液 DNA ，其移動位置集中在近 linear form 位置，沉澱回收後則回後 circular 型式。 Southern blot 分析電破後發育到 64 cell stage 胚胎，有以 extrachromosome 質體型式存在，綜合以上結果，以 3.5kv , NP = 2 , cycle = 12 , Tb = 1.6s , Tp = 120 μs , D = lmm 條件下，轉殖外來基因到精子，能得到 50 ％以上，大量且形態正常的轉殖魚。