氧化性壓力在促進胰島素分泌及誘導細胞死亡訊息上的雙向影響

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) 包括了 superoxide（O2•－）、hydroxyl radical（•OH）、nitric oxide （NO•）、peroxynitrite（ONOO－）。ROS 是因為 O2 在體內正常代謝而產生並且在細胞訊息傳遞中扮演很重要的角色。但是在現今，越來越多的環境荷爾蒙、污染物，甚至藥物及生活中的壓力等等，都會造成體內的 ROS 量增加；而先前亦有很多文獻指出 ROS 的增加與很多疾病的產生有關，糖尿病就是其中之ㄧ。 很多證據顯示，胰臟中的β-cell長期處在高糖的情況下，會造成過氧化物的增加、胰島素分泌減少；並在用H2O2500μM處理大鼠(Wistar Rat) 的胰島細胞2小時之後，也的確看到了胰島素分泌減少的現象。但是ROS 在體內又與免疫系統及氧化還原反應息息相關，並由於ROS主要代謝生成是在粒線體，而粒線體被證明與胰島素分泌有關，且胰臟所含的抗氧化酵素（例如：catalase、glutathione peroxidase）遠遠低於體內其他器官。這種種的因素，顯示 ROS 與胰島素分泌的相關性極高，更讓人好奇的是在這中間是否存在著除了抑制之外的反應。而在本篇實驗，我們分為兩個不同的方向，目的是要去探討高或低劑量 ROS 對胰島細胞的胰島素分泌或者胰島細胞的死亡上所扮演的角色。 在我們的實驗中，發現以 H2O2處理人類及雄性鼷鼠的初代培養胰島細胞 (primary islet cells)，在不致引起細胞毒性的低劑量下 ( 5、10、20μM 處理四小時) ，的確存在著會刺激胰島素分泌的現象。而在處理Sodium nitroprusside (SNP：提供NO)的組別，也同樣看到在0.01、0.05、0.1 mM(處理四小時)劑量下促進胰島素分泌的反應。另外合併給予 N-acetylcysteine (NAC：抗氧化劑) 時，不論處理H2O2 或SNP 均可見到胰島素分泌促進被回復的現象。與此同時，我們也看到了細胞內的鈣離子增加、ERK、AKT及PKC 等蛋白磷酸化的現象；另外在細胞死亡的部份，則如預期的看到了高劑量 ROS 的確造成了胰島細胞死亡 (H2O2 50、100、200μM or SNP 0.1、0.25、0.5 mM)，而預處理NAC則可以預防細胞因為 ROS 所導致的死亡。我們進一步的根據藥物處理組的粒線體細胞膜電位損傷、Caspase3 活性增加及 JNK蛋白磷酸化來證明H2O2所導致的細胞死亡屬於apoptosis。不過在SNP所導致的細胞死亡則不同於H2O2 ，所以需要更進一步的實驗去做證明，故不在此討論。 我們希望能藉這些實驗以釐清 ROS 在胰臟所扮演的調控角色，是除了細胞死亡外，對於胰島素分泌的正向反應，並期望能更進一步去探討內生性 ROS 在保護胰臟β-cell 及促進胰島素分泌相關訊息傳遞上所扮演的角色。

Reactive oxygen species (ROS) are well-known to induce many biological reactions, but the role of the oxidative stress on the function of pancreatic β-cell remains unclear. In this study, we attempted to elucidate the effects of ROS on β-cell damage and insulin secretion and its molecular mechanism.We treated islets isolated from human or male ICR mice and NIT-1 cell (mice prancreatic beta-cell line) with H2O2 (5, 10, 20, 50, 100 and 200μM) and SNP (0.01, 0.05, 0.1, 0.25 and 0.5 mM) to investigate what influence by which. First, we determined NIT-1 cell viability which treated with H2O2 and SNP. Then, low dose of H2O2 (5, 10 and 20μM) and SNP (0.01, 0.05 and 0.1 mM) have been investigated what effect on the insulin secretion. After treatment of 5, 10 and 20μM H2O2 or 0.01, 0.05 and 0.1 mM SNP, insulin secretion of primary islets has both been promoted. Both H2O2- and SNP-increased insulin secretions were reversed in the presence of N-acetylcysteine (NAC：an antioxidant). We also investigate the effects of high dose of H2O2 and SNP on pancreatic β-cell death. We found that Sub-G1 cells were increased by treatment of H2O2 and SNP. In addition, H2O2 increased intracellular Ca2+ level, caspase3 activity and mitochondrial membrane potential depletion. However, SNP didn’t increase intracellular Ca2+ level and caspase3 activity. These results show that H2O2 and SNP may through different pathways to induceβ-cell death. The present study demonstrated that low dose of ROS promoted insulin secretion of β-cells. On the other hand, high dose of ROS caused β-cell death. These data help us to better understanding of the role of oxidative stress on the physiological and toxicological regulation of pancreatic β-cells.