草蝦alpha-2 macroglobulin基因啟動子的選殖與分析

Abstract

alpha-2 macroglobulin在對蝦為一血淋巴球專一性且具免疫可誘導性表現的基因，本實驗中由草蝦血球萃取genomic DNA，並建立一嵌入片段長度範圍約11.5 kb至14.5 kb，平均長度約13 kb的genomic DNA library (1×108 pfu/ml)。利用extender PCR及library screening的方式分別獲得在轉譯起始位前535 bp和1.2 kb的alpha-2 macroglobulin DNA片段；將此兩DNA片段構築在EGFP綠螢光報導基因後進行斑馬魚卵顯微注射，結果顯示兩DNA片段皆可驅動EGFP綠螢光報導基因在斑馬魚表現，表現率分別為30%和40%(n=300)，在螢光表現率上1.2 kb片段表現能力較535 bp片段高出約10%；而在表現綠螢光的個體中，兩不同長度的片段均有70%為專一性強表現在肌肉束上。利用果蠅類巨噬細胞Schneider 2 (S2)細胞株進行轉染實驗，此兩DNA片段皆可驅動EGFP及firefly luciferase報導基因的表現；而在luciferase活性測試上，若以未含有啟動子的pGL3-basic empty vector為基礎比較，535 bp片段和1.2 kb片段表現能力分別為110倍(SD=16.3)和150倍(SD=18.0)。由上述斑馬魚螢光表現率和S2細胞luciferase活性測試，可推測1.2 kb的片段中可能包含有535 bp片段所沒有的cis-element來加強基因的表現。藉由斑馬魚系統和果蠅S2細胞株的實驗，可以證明草蝦A2M基因轉譯起始位前1.2 kb的DNA片段為一具有驅動基因強表現的DNA片段。