BCL10切割機制之探討

Abstract

轉錄因子NF-κB是調控淋巴球的活化中最主要的角色，其作用包括促進淋巴球的增生、分化以及細胞激素的製造。近年來的研究陸續指出，CBM complex(CARMA1-BCL10-MALT1)參與調控抗原受體活化NF-κB的路徑中。在實驗室先前的研究與Rebeaud, F. et al. (2008)的研究中，發現在淋巴球活化後，BCL10有被誘導切割的現象，而這個動作可能是透過類似caspase的para-caspase MALT1所造成。除了淋巴球之外，最近也有許多研究陸續證明CBM complex也參與在一些ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)-containing receptor、TLR(Toll-like receptor)或GPCR(G protein-coupled receptors)所活化的NF-κB路徑中，雖然越來越多的研究探討BCL10在NF-κB活化路徑的調控，但對於BCL10切割的機制或者是否還有其他生理上的意義上的研究則付之闕如。因此我們試圖建立不同細胞活化NF-κB的模組，想要知道其他細胞活化NF-κB的路徑是否也有CBM complex的參與，並且觀察BCL10是否有發生被誘導切割的現象，來找出BCL10切割的機制以及其在生物中意義。 我的研究方法是利用各種刺激物(PMA/ionomycin、TNF-α、LPS、zymosan、IL-1β、Helicobacter pylori)來刺激不同細胞(淋巴系細胞：Jurkat 、Raji、Akata、NK，骨髓系細胞：Raw264.7、THP-1，非血球系細胞：HeLa、AGS、293T)用以活化NF-κB。我們以IκBα的降解以及冷光酵素測定法觀察NF-κB活化的狀況，並以免疫沈澱法將BCL10沈澱下來再以磷酸水解酶處理，觀察BCL10切割的情形。當刺激物活化NF-κB路徑，但不見BCL10的變化時，使用核酸干擾BCL10來驗證BCL10是否參與在活化路徑中。最後再以NF-κB抑制劑(MG132、Bay11-7085)以及鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)，在Jurkat細胞中觀察對BCL10切割的影響，找出調控BCL10切割的因子。 本研究結果發現BCL10的切割只發生在T細胞、B細胞以及自然殺手細胞中，而TNF-α及IL-1β所誘導的NF-κB活化路徑中不需要BCL10的參與。雖然BCL10-MALT1存在於許多細胞中，但是MALT1在NF-κB活化時所誘導BCL10的切割卻不是一個共通的現象，顯示此切割的行為還需要MALT1以外的因子參與。當我們將Jurkat細胞以NF-κB抑制劑前處理後，再以PMA/ionomycin刺激，發現經MG132(抑制IκBα的降解)前處理之後並不影響BCL10的切割，但是經Bay11-7085(抑制IκBα的磷酸化)前處理過後的細胞，其BCL10的切割有被抑制的現象，顯示IKK的活性可能是造成BCL10切割的原因。最後我們以鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)使細胞內鈣離子濃度降低，可以發現NF-κB的活化以及BCL10的切割有被抑制的情況，顯示鈣離子可以幫助BCL10的切割以及NF-κB的活化。 由於不同細胞以不同的CARD-containing adaptor組合成CBM complex來活化NF-κB的路徑(例如T細胞、B細胞以及NK細胞所使用的是CARMA1，骨髓系細胞所使用的是CARD9)，因此BCL10的切割可能與CARMA1的選用有關。CRAMA1與CARD9在蛋白質構造上的差異在於CARD9缺少了linker以及MAGUK domain，這個差異性使CARD-containing adaptor在活化上的調控有很大的不同，而這個調控的不同可能就是造成BCL10切割與否的關鍵。先前在實驗室的研究顯示磷酸化的BCL10更容易被MALT1所誘導切割，在Zeng, H. et al.(2007)的研究也指出IKKβ具有將BCL10磷酸化的能力，進而使之降解而抑制NF-κB的活化。因此我們推論，BCL10切割的機制可能與調控CARMA1-BCL10-MALT1 complex的活化有關，透過CBM complex活化IKK complex後，以IKKβ的活性將BCL10磷酸化而使之造成切割的結果，而鈣離子可能透過某種機制協助參與切割的調控當中，至於BCL10切割在生物中所扮演的角色仍是值得繼續探討的部分。