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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/82429
標題: | 以額外表達 Hac1 策略增強 Komagataella phaffii (Pichia pastoris) 外泌效率 Enhancement of Secretory Efficiency by Additional Expression of Hac1 in Komagataella phaffii (Pichia pastoris) |
作者: | Chun-Fu Yu 游鈞富 |
指導教授: | 黃慶璨(Ching-Tsan Huang) |
關鍵字: | Pichia pastoris,外泌,Hac1,異源蛋白質生產,未摺疊蛋白質, Pichia pastoris,Secretion,Hac1,Heterologous protein production,Unfolded protein response, |
出版年 : | 2021 |
學位: | 碩士 |
摘要: | "畢赤氏酵母菌 Pichia pastoris 為廣泛應用的異源蛋白質表達系統,兼具單一細胞與真核生物的特點,其優勢為生長快速、培養成本低廉並可進行高密度培養,且具有適當的轉譯後修飾及外泌重組蛋白質的能力。然而,P. pastoris 經誘導大量生產異源蛋白質時,往往會因為內質網的折疊效率不足,導致過多的未折疊蛋白質累積於內質網中,造成內質網壓力 (endoplasmic reticulum stress),且促使未折疊蛋白質反應 (unfolded protein response, UPR) 發生。位於內質網膜上的 Ire1 (inositol-requiring enzyme 1) 受內質網壓力影響,會活化自身的核酸內切酶活性,切除轉錄因子 HAC1 mRNA 的內含子。藉此調控其下游基因,協助蛋白質折疊外泌;或促使蛋白質降解來舒緩內質網壓力。 本研究以 E2-Crimson 四聚體紅色螢光蛋白質作為模式蛋白質,發現甲醇誘導 27 小時後,額外表現轉錄因子 Hac1 之菌株其 HAC1 基因 mRNA 相對表現量提升了 14.8 倍。觀察螢光量發現,額外表現 Hac1 使 E2-Crimson 的外泌量提升了 1.6 倍。UPR 之相關基因 KAR2 的 mRNA 相對表現量提升,為 1.45 倍;內質網相關蛋白質降解途徑 (ER-associated protein degradation) 之相關基因 HRD1 及 UBC1 的 mRNA 相對表現量則降低,分別為 0.64 倍及 0.47 倍。進一步將此策略應用於諾羅病毒 P 蛋白質的外泌生產。P 粒子 (P particle) 是由諾羅病毒衣殼蛋白質中的突出區 (protruding domain) 組成,可用於生產類病毒顆粒疫苗;具有多抗原呈現的功能,可作為疫苗發展平台。本實驗室在前人 P. pastoris 胞內表現諾羅病毒 P 蛋白質的基礎下,已成功地將諾羅病毒 P 蛋白質外泌至胞外。本研究希望藉由額外表現轉錄因子 Hac1 的方式提升諾羅病毒 P 蛋白質之外泌效果,讓其於回收及純化上更有效率,增加 P. pastoris 表現系統的應用性。目前已成功證實額外表現 Hac1 可提升以 P. pastoris 生產諾羅病毒 P 蛋白質的外泌效率。" |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/82429 |
DOI: | 10.6342/NTU202103163 |
全文授權: | 同意授權(全球公開) |
電子全文公開日期: | 2023-09-14 |
顯示於系所單位: | 生化科技學系 |
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