以額外表達 Hac1 策略增強 Komagataella phaffii (Pichia pastoris) 外泌效率

Abstract

"畢赤氏酵母菌 Pichia pastoris 為廣泛應用的異源蛋白質表達系統，兼具單一細胞與真核生物的特點，其優勢為生長快速、培養成本低廉並可進行高密度培養，且具有適當的轉譯後修飾及外泌重組蛋白質的能力。然而，P. pastoris 經誘導大量生產異源蛋白質時，往往會因為內質網的折疊效率不足，導致過多的未折疊蛋白質累積於內質網中，造成內質網壓力 (endoplasmic reticulum stress)，且促使未折疊蛋白質反應 (unfolded protein response, UPR) 發生。位於內質網膜上的 Ire1 (inositol-requiring enzyme 1) 受內質網壓力影響，會活化自身的核酸內切酶活性，切除轉錄因子 HAC1 mRNA 的內含子。藉此調控其下游基因，協助蛋白質折疊外泌；或促使蛋白質降解來舒緩內質網壓力。 本研究以 E2-Crimson 四聚體紅色螢光蛋白質作為模式蛋白質，發現甲醇誘導 27 小時後，額外表現轉錄因子 Hac1 之菌株其 HAC1 基因 mRNA 相對表現量提升了 14.8 倍。觀察螢光量發現，額外表現 Hac1 使 E2-Crimson 的外泌量提升了 1.6 倍。UPR 之相關基因 KAR2 的 mRNA 相對表現量提升，為 1.45 倍；內質網相關蛋白質降解途徑 (ER-associated protein degradation) 之相關基因 HRD1 及 UBC1 的 mRNA 相對表現量則降低，分別為 0.64 倍及 0.47 倍。進一步將此策略應用於諾羅病毒 P 蛋白質的外泌生產。P 粒子 (P particle) 是由諾羅病毒衣殼蛋白質中的突出區 (protruding domain) 組成，可用於生產類病毒顆粒疫苗；具有多抗原呈現的功能，可作為疫苗發展平台。本實驗室在前人 P. pastoris 胞內表現諾羅病毒 P 蛋白質的基礎下，已成功地將諾羅病毒 P 蛋白質外泌至胞外。本研究希望藉由額外表現轉錄因子 Hac1 的方式提升諾羅病毒 P 蛋白質之外泌效果，讓其於回收及純化上更有效率，增加 P. pastoris 表現系統的應用性。目前已成功證實額外表現 Hac1 可提升以 P. pastoris 生產諾羅病毒 P 蛋白質的外泌效率。"