人類γC型水晶體蛋白聚集行為之研究

Abstract

" 白內障全世界第三大宗的視力損傷疾病，起因為人類水晶體中的水晶體蛋白聚集。人類γ型水晶體蛋白為水晶體中的主要結構蛋白之一，被認為是白內障致病蛋白的主因之一，其中諸多γ類型的蛋白已研究多年，但人類γC型水晶體蛋白的相關研究相對較少，極具研究潛力。 人類γC型水晶體蛋白(Human γC Crystallin, HγCC)具有173個殘基，與人類γD型水晶體蛋白有71%的序列同一性，為富含β-sheet結構的結構域(domain)構成。本篇研究透過基因工程方式建立質體pEHisHγCC，轉入E.coli. BL21(DE3)系統進行表達，透過小量生產方式篩選出最適化的生產條件：30℃、0.5 mM IPTG、誘導前O.D.600 nm為1.5、誘導時間12小時，隨後以此條件進行大量生產，成功純化出帶有6×Histidine親和性標籤的HγCC，每100 ml培養液蛋白質產量為10.19±1.13 mg，並透過質譜分析與電泳分析確認分子量、純度達94.27%。 為了測定在不同條件下的HγCC聚集行為，我們透過濁度、ThT螢光光譜、ANS螢光光譜、Tryptophan螢光光譜、遠紫外光圓二色光譜與傅立葉轉換紅外線光譜等分析，證實pH 2酸性條件會誘導HγCC結構展開，錯誤摺疊而生成類澱粉纖維，整體二級結構比例變化趨勢為β-sheet下降、Random增加，再透過文獻模型擬和得到類澱粉纖維生長曲線，此外，也透過共軛聚焦顯微鏡與穿透式電子顯微鏡檢測聚集體的微觀型態，發現蛋白質會形成纖維網路結構，且55℃生成的結構相較37℃更為緊密；而在pH 7中性條件下，37℃培養後仍維持原態蛋白結構，而55℃培養後則會生成極少量的纖維網路，伴隨著些許的疏水區域裸露，但對整體三級結構與二級結構比例影響不大；最後，透過動態光散射法分析聚集物的尺寸分佈，發現酸性培養生成的聚集體尺寸遠大於中性培養生成的聚集體。 "