使用單分子螢光共振能量轉移技術研究螢光標記之核醣體亞基如何搜尋訊息核醣核酸的轉譯起始位

Abstract

細菌中mRNA的轉譯效率顯著受到起始階段的影響。在起始階段，核醣體的30S次單元(亞基)與mRNA的結合，主要是透過位於mRNA起始密碼子上游約6 個鹼基的Shine-Dalgarno (SD) 與30S次單元16S rRNA中的anti-SD (aSD) 序列互補。先前研究表明，SD-aSD 相互作用穩定了30S-mRNA的複合體，並在起始因子 (initiation factor) 和起始tRNA協助下，30S次單元固定在起始密碼子處。然而，關於mRNA 如何招募30S次單元以及30S次單元如何搜索SD序列，得知甚少。在本論文中，我們通過單分子螢光共振能量轉移 (smFRET) 觀察了螢光標記的30S次單元與mRNA的相互作用。我們的觀察表明，30S 亞基首先與位於 5’-非轉譯區 (5’-UTR) 的非特異性位點結合，然後通過未知機制轉移到起始位點。此外，具有長且非結構化 5’-UTR 的人工mRNA (GAA52-sRBS)具有高30S次單元招募效率，但此效率是否與自然發生的mRNA類似則是未知。因此，我們透過和E. coli 中具有高轉譯效率的lpp mRNA進行比較，發現GAA52-sRBS的招募效率為lpp mRNA的11倍。然而，GAA52-sRBS 的實際轉譯效率僅為lpp的50%。此外，透過smFRET的即時觀察，發現30S次單元可能會與lpp 5’-UTR互動。這些結果說明轉譯起始的機制比我們的預期複雜。在後續的實驗中，我們將利用新的螢光標記30S次單元，將標記置於靠近mRNA5’端出口處的S6蛋白，此類30S次單元將可偵測5’-UTR的動態變化，以揭示更多轉譯起始機制的細節。