WDR5參與犬瘟熱病毒質內包涵體形成及病毒複製之角色

Abstract

許多副黏液病毒（paramyxoviruses），如麻疹病毒（MeV），犬瘟熱病毒（CDV），呼吸道合胞病毒（RSV），人副流感病毒（HPIV3）等，它們感染的細胞中都出現了包涵體（inclusion body）。在過去的研究中，包涵體被認為是病毒廢棄物（如未正確折疊的病毒蛋白，序列錯誤的病毒核酸等）的聚集地。然而，最近的研究指出，細胞質包涵體是病毒進行複製的場所，病毒蛋白，病毒RNA，病毒mRNA，聚集在包涵體內，提高了病毒複製的效率。但是目前還沒有研究能夠完整闡述包涵體的形成機制，尤其是宿主端如何調控病毒包涵體形成之研究非常缺乏。包涵體的形成，有兩項發現是被廣泛認可的：第一點，病毒的N蛋白（nucleoprotein）和P蛋白（phosphoprotein）對於包涵體的形成至關重要；第二點，形成包涵體的各種物質通過液相分離（liquid-liquid phase separation）的方式聚集。此外，在麻疹病毒的研究中，WDR5能夠和包含病毒N，P，L蛋白的複合物結合，以及，降低（knockdown）WDR5抑制了病毒的複製，所以宿主蛋白WDR5可能參與包涵體的形成。同為麻疹病毒屬（Morbillivirus genus）的犬瘟热病毒，仍然廣泛存在于未接種疫苗的家犬，以及一些野生宿主中，如野生浣熊，野生狐狸。目前仍然沒有治療犬瘟熱的特效藥，而且，對於犬瘟熱的研究大多集中在臨床，病毒在細胞內的機制研究極其匱乏。所以我們希望通過對犬瘟熱病毒包涵體的研究，去尋找治療的新方向，其次，也希望能夠對其他副黏液病毒包涵體的研究提供幫助。在我們的研究中，首先想確認在野生型病毒感染的情況下，WDR5的分佈情況。但是市售的WDR5抗體存在低親和力的問題，另外我們也無法找到一種能同時過量表達（overexpress）WDR5並且對犬瘟熱病毒有敏感性的細胞株，所以我們在Vero細胞中共表達（co-express）犬瘟熱病毒的N，P蛋白，來模擬全病毒引發的包涵體，以此建立了犬瘟熱N-P共表達模型（N-P co-expression model）。在此模型之下，我們過表達WDR5-GFP，觀察到WDR5和包涵體樣點（IB-like puncta）有共定位（colocalization）。第二，我們通過免疫共沉澱的方法（co-immunoprecipitation），觀察到WDR5和N-P複合物有結合，這也暗示了WDR5可能參與犬瘟熱包涵體的形成。第三，我們通過shRNA和siRNA的方式降低（knockdown）WDR5的表達，觀察到犬瘟熱病毒蛋白的複製受到了抑制，證明WDR5對病毒複製的重要作用，也為WDR5在包涵體的形成發揮作用提供間接證據。第四，我們用WDR5抑制劑處理N-P共表達模型，產生包涵體樣點的細胞比例從62%降到25%，直接證明WDR5在包涵體的形成中扮演至關重要的作用。最後，我們用WDR5抑制劑（CC50：101.6 µM）抑制犬瘟熱病毒的感染，50 µM的抑制劑能夠顯著緩解病毒的感染，但即使將抑制劑濃度提高到100 µM也無法完全阻斷病毒感染，這個結果與第四點中的結果符合，因為WDR5抑制劑無法破壞所有的病毒包涵體。 總而言之，我們直接證明了WDR5參與到犬瘟熱病毒的包涵體的形成中，並且發現WDR5可以作為新的犬瘟熱病毒治療標的（target）。