利用基因改造小鼠探討絲胺酸蛋白酶與小鼠橫膈膜發育的相關性

Abstract

"絲胺酸蛋白酶(serine protease) 在生物體中扮演著非常重要的角色，也與許多小鼠及人類疾病的病因有關。其中第二型穿膜絲胺酸蛋白酶 (Type II transmembrane serine proteases, TTSP) 的缺失與小鼠及人類的發育疾病都有關聯。 Hepsin屬於TTSP，主要表現在肝臟，少量表現在其他組織，但對其發育相當重要，例如Hepsin會調控脂肪細胞分化、胚胎耳蝸的發育以及胚胎著床等。先前本實驗室利用Hepsin基因改造小鼠探討絲胺酸蛋白酶與小鼠橫膈膜發育的相關性，發現 Hepsin基因剔除(Hepsin-/-)小鼠肺功能較野生型小鼠(Hepsin+/+) 差，且Hepsin-/-成鼠肝臟末緣至肋骨最後一節距離較小，上述表徵類似橫膈上提(diaphragmatic eventration) 的病理現象，此外Hepsin-/-成鼠橫膈膜也較小，橫膈膜病理切片也發現中央肌腱 (central tendon) 區域較薄。進一步對胚胎橫膈膜發育進行研究，以切片染色分析小鼠E13.5胚胎時發現Hepsin -/-胚胎橫膈膜前驅結構(pleuroperitoneal fold, PPF)面積、肌肉前驅細胞(muscle precursor cell)及纖維母細胞(fibroblast) 的細胞計數皆無變化。 為了釐清先前成鼠與胚胎結果的差異性，本研究首先利用回交C57BL/6Jnarl 超過10代以上之6-8週齡成鼠作分析Hepsin各基因型小鼠之肝臟末端至肋骨末緣之距離，發現無論公鼠或母鼠，Hepsin -/-成鼠肝臟末緣至肋骨最後一節距離較異合型(Hepsin+/-) 成鼠與Hepsin+/+成鼠小，也有類似橫膈上提的情形。進一步測量橫膈膜的直徑與面積，觀察到無論公鼠或母鼠，Hepsin -/- 成鼠橫膈膜的直徑與面積皆較小。此外，無論公鼠或母鼠，Hepsin -/- 成鼠其橫膈膜肌肉層無變化，但中央肌腱層皆明顯較薄。接著分析E13.5小鼠胚胎，利用切片H E染色，量測其PPF面積，發現Hepsin -/- 小鼠胚胎PPF面積明顯小於Hepsin+/+與Hepsin+/- 小鼠胚胎PPF面積。進一步對E13.5小鼠胚胎進行切片免疫螢光染色，計數每個切片所有PPF中的PAX7 (肌肉前驅細胞)陽性細胞與GATA4 (纖維母細胞)陽性細胞，結果顯示Hepsin -/-小鼠胚胎其纖維母細胞無變化，但肌肉前驅細胞明顯較少。接著測量E13.5胚胎整體橫膈膜直徑及面積，結果發現無論在胚胎橫膈膜直徑橫向、縱向與面積，三種Hepsin基因型小鼠(Hepsin -/-、Hepsin+/+與Hepsin+/-)間皆無明顯差異。以肌腱前驅細胞(tendon precursor cell)的標誌性蛋白mouse Scleraxis (mSCX) 的RNA作為探針利用全標本包埋原位雜合技術(whole mount in situ hybridization, WISH)，偵測E13.5胚胎橫膈膜肌腱的型態與含量，結果發現E13.5胚胎橫膈膜，三種Hepsin基因型小鼠(Hepsin -/-、Hepsin+/+與Hepsin+/-)間皆無明顯差異。 綜合上述結果，推測Hepsin 缺失可能造成小鼠橫膈膜發育異常，並且Hepsin 可能透過影響肌肉前驅細胞，進而影響橫膈膜中央肌腱的發育，造成類似橫膈上提的病理現象。"