可能調控鼠傷寒沙門氏菌fimY基因表現的基因選殖與環境因子之探討

Abstract

"沙門氏菌(Salmonella)隸屬於腸內桿菌科(Enterobacteriaceae)，為一兼性厭氧 型革蘭氏陰性菌，由其腸道沙門氏菌亞種的鼠傷寒沙門氏菌血清型(Salmonella enterica serovar Typhimurium, S. Typhimurium)所造成的感染則是重要的人畜共通傳染病之一。S. Typhimurium在小腸上皮細胞的黏附作用被視為其致病機制的初 始階段，與之相關的毒力因子即為第一型線毛(type 1 fimbriae, T1F)。T1F由fim gene cluster所編碼，在fim gene cluster內，fimA編碼T1F的主要結構蛋白，而fimZ是主要的正向調控基因。FimZ可以直接結合於fimA的啟動子部位並增強結構基因的表達。fimY則是另一個正向調控基因，可以直接增強fimZ的表達。先前的研究發現了許多可以調控fimZ的上游基因成分(genetic elements)和環境因子(environmental factors)，而fimY上游的相關研究則十分有限。本研究旨在對T1F調控網絡fimY的部分進行探討，為能夠更完整地闡述S. Typhimurium的致病機理提供相關理論基礎。為了從S. Typhimurium中選殖能夠正向調控fimY的genetic elements，本研究使用質體pACYC184構建了一個平均插入片段大小約為2,000 bp的基因體庫(genomic library)，並最終產生了8,000多個包含重組質體的菌落。將菌落接種於LB agar上培養48小時後，若其可以與酵母菌發生凝集反應，則很有可能是通過上調fimY的表達來增強了第一型線毛的表現，當然這需要反轉錄聚合酶鏈鎖反應的進一步驗證。為了將篩選到特定基因的機率提高至90%以上，根據Carbon-Clarke equation，超過5,591個菌落被挑選並測試，結果均為陰性。後又將可能的調控基因sirA選殖入同樣的質體，並轉形入S. Typhimurium進行測試，結果仍無法產生凝集。為了探測可能影響fimY表達的環境因子，通過將fimY的啟動子區域DNA選殖入載體pMC1403，並轉形至S. Typhimurium，也就是構建了一個fimY-lacZ reporter system於S. Typhimurium。將此菌株分別培養在25 °C、37 °C 和 42 °C的環境中，發現fimY啟動子的活力會隨溫度升高而增強，T1F的表現量也呈現出類似的趨勢。酸性和鹼性的環境壓力對於 fimY 表達的影響也詳加探討，與pH=7的培養環境相比，fimY啟動子在pH=4的環境中幾乎不表 現活力。而在pH=8的情況下fimY啟動子的活力要高於pH=7的情況。在低Mg2+濃度(10 μM)環境壓力下，fimY啟動子的活力與對照組類似，並無明顯差異。環境因素調控fimY表達的具體機制仍須進一步的研究闡明。"