應用水母綠熒光蛋白研究基因在胚胎發育早期的表現動態

Abstract

以水母綠螢光蛋白cDNA (GFP cDNA）為報導基因，具有容易檢測、高敏感度、可在活體直接觀察等優點。為評估其應用於稻田魚基因轉殖模式的可行性，將建構有human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter的GFP cDNA基因片段（pGreen LANTERN)，經Sca I線性化後，各以5μg/ml、7.5μg／ml、10μg/ml三種不同DNA濃度，進行稻田魚未授精卵顯微注射實驗。授精後12小時（stage 15）在FITC螢光濾鏡下，3組實驗組皆開始可以偵測到綠色螢光出現，表現率分別是5μg/ml組為50％、7.5μg /ml組為63％、10μg／ml組則為100%；比較表現GFP胚胎授精後24小時（stage 19）存活率，發現10μg/ml組為0，明顯較5μg/ml組（40%）、7.5μg/ml組（50%）低，顯示乙太高濃度強?動子表現GFP易影響稻田魚胚胎的正常發育。觀察7.5μg/ml組表現GFP存活的胚胎，其綠色螢光至少可維持至孵化後10天，且與PBS對照組比較，顯示在稻田魚發育早期無內生性的綠色螢光幹擾，證明應用GFP cDNA在稻田魚轉殖模式研究基因表現是可行的。 為研究鯉魚視紫質基因在胚胎發育早期的調控表現，分別建構以鯉魚視紫質（rhodopsin）基因（第二型）上游3.5kb與0.5kb驅動的GFP cDNA基因片段，觀察其在基因轉殖稻田魚胚胎的表現情形。視紫質上游3.5片段在授精後18小時（stage 16）開始驅動GFP cDNA表現，進入原腸胚初期（授精後48小時，stage 23）曾短暫消失，在授精後72小時（stage 27）又再度可以偵測到GFP表現，且僅限於眼睛部位。眼中的綠色螢光至少可以維持至孵化後一天，顯示鯉魚視紫質基因上游3.5kb對於視紫質的表現具有組織專一性。但是在轉殖此基因上游0.5kb片段時發現其對於驅動GFP cDNA表現的能力較弱，自授精後18小時（stage 16）開始可以偵測到微弱GFP表現；原腸胚階段並沒有短暫消失現象，且只在卵黃囊外圍有微量GFP分佈。發育至授精後96小時，GFP都僅在卵黃囊分佈；眼睛部位則在孵化前一天開始有綠色螢光產生，顯示此片段不具組織專一性。因此，與鯉魚視紫質基因組織專一性表現有關的序列，應介於上游0.5-3.5kb間。 另一方面為瞭解由吳郭魚選殖出c-ski基因在魚類胚胎早期表現情形，將此基因上游3kb建構至GFP cDNA表現載體。經基因轉殖後，在稻田魚胚胎發育至授精後12小時（stage 15）開始表現，進入原腸胚期後，則專一在卵黃囊外膜表現，至授精後120小時（stage 34）達到最高，並持續至孵化。孵化後，隨著卵黃囊消失而減弱，至孵化後第5天完全消失。顯示吳郭魚c-ski的表現可能與維持卵黃囊正常生理活動有關。