電穿孔法在牡蠣、文蛤與豐年蝦之基因轉殖研究

Abstract

電穿孔法（Electroporation）常被用於胚胎與細胞株之基因或其他物質轉殖之用，但其穿孔機制與電脈衝擊之關係至今仍不十分清楚。本文嘗試以兩種不同電脈衝波型：1．指數式遞減波（Exponential decay wave）及2．方形波（Square wave）之電穿孔儀，以染劑伊紅為轉殖物質，藉以探討牡蠣卵在各種電場下，電脈衝擊之各參數值在物質轉殖上所扮演的角色，及不同卵割時期之牡蠣胚胎對電脈衝擊的耐受性與封孔效率之影響。本結果發現在指數式遞減波組中，高電容（125?960μF）與適當電壓（100?400V）的組合較適合以牡蠣卵進行物質轉殖，其所得電穿孔效率（ε % ）為： C1.4•E2.35 /(1.671*10^9) ε%=｛1-(1/2) ｝•100% ε：電穿孔效率 C：電容 電容 E ：電場強度 而在方形波組中，脈寬（Pulse width）、脈衝數（Number of pulse）及週期次數（Cycle）與物質轉殖有正相關性；而樣品體積（Volume) 及極針和液面距離（Dial）與物質轉殖間有負相關性。此外由反應時間（Burst time）可推測牡蠣卵封孔時間約為200?250msec.。在不同卵裂階段中，其卵隨不同卵裂時期對電脈衝擊的耐受性有增強的趨勢；而在指數式遞減波組中，其卵封孔時間約為20秒。應用上述實驗所得電穿孔法基本參數值特性，利用pmiwZ(β-galactosidase gene)為轉殖基因，以牡蠣、文蛤與豐年蝦為基因轉殖模式動物，經β-galactosidase活性測試發現，在控制組中，牡蠣、文蛤與豐年蝦皆僅在消化道呈藍色反應；在牡蠣與文蛤基因轉殖組中，其面盤幼蟲呈全身性藍色反應，少部分呈鑲嵌狀藍色反應。在2?16細胞期之牡蠣與文蛤胚胎進行基因轉殖時，藍色反應百分率各為5.36％±1.74％與19.12％±8.97%，在豐年蝦基因轉殖組中，其40隻無節幼蟲中，僅3隻在泳肢上呈藍色反應，而在豐年蝦子代測試中，第8與第37對豐年蝦子代呈全身性藍色反應，藍色反應百分率為4.44％±2.56％。