臺灣飯匙倩心臟毒蛋白於人類紅血球結合部位之研究—分子層次之作用機制探討

Abstract

?了證明心臟毒蛋白(Cardiotoxin)作用於紅血球之部位，我們利用化學修飾法，將胺基酸序列中的第24及第26甲硫基丁氨酸(Methionine)很專一性的以溴化氰切去，發現此衍生物的生物活性幾乎完全消失，但免疫能力依舊存在。利用螢光光度計(Fluorescence spectrophotometer)研究此衍生物與ANS複合物的螢光特性而知發射光譜由原來的540nm波長移徙到480nm，這證明ANS與某一非極性基團結合所致，而此基團群可能就是毒蛋白的第22至第26氨基酸所構成的非極性環(nonpolar loop)，如果此種推論正確，則甲硫基丁氨酸被切除後，使特異的結合部位發生立體構造的改變，直接使生物活性降低，甚或消失。 同時，我們將血球細胞以α-chymotrypsin; N-Acetylneuraminidase及Cytochalasin B處理，用以切去一直被認?是離子通透細胞及醣類運轉通道的Band 3；除去細胞膜外主要負電荷來源的Sialic acid或阻絕Actin的結合部位以抑制Actin的聚合，再將處理的血球細胞與碘-125標示之心臟毒蛋白反應，進一步做結合分析(binding assay)，顯示出心臟毒蛋白與紅血球之結合不受該處理之影響。 以〔125I〕-CTX繼續研究心臟毒蛋白究竟結合於細胞膜的那一部位時，使碘－125標示之毒蛋白與血球懸浮液在37℃及15℃下反應15分鐘，再製備細胞膜，其次，以0.1N NaOH或0.5％ triton X-100個別抽取細胞膜，發現放射性碘－125全部存在無法抽取的殘留物中，與抽出液，殘留物的化學組成分析做一比較，我們可以確定碘－125毒蛋白的最終標的(target)可能是神經磷脂質(Sphingomyelin)，而有少部份在band 1, 2造成aggregate，此種凝聚的band 1, 2也無法被這兩種試劑抽取。 因?PBS (phosphate-buffered saline)係生物系統中細胞培養最廣用的緩衝溶液，我們因而比較它與實驗所用的plasma expander（代用血漿，商品名?Moriamin）之效果，發現血球在PBS內很快沉降，造成實驗上很大的困擾，此外，若血球與毒蛋白在37℃作用時，短時間內?令細胞溶血，無法形成Non-lytic period。凝膠電泳分離法，顯示出血球被毒蛋白作用後，band 3, 4.2, 5含量明顯下降，且易造成band 5和band 1, 2形成凝聚。