肝癌形成早期雄激素路徑促進微核醣核酸-216a之轉錄進而降低抑癌基因TSLC1表現之研究

Abstract

microRNA 可能在癌症中扮演類似致癌基因或是腫瘤抑制基因的重要角色， 而在肝癌 (Hepatocellular carcinoma；HCC) 中也已經發現許多表現異常的 microRNA， 但是在肝癌形成的早期過程， 是否就有 microRNA 變異參與在其中卻很少被探討。 本研究利用肝癌鄰近的非腫瘤組織當作癌症前期組織， 藉著 Real-Time PCR 分析 22 個與 HCC 相關的 microRNA 後， 結果發現 miR-216a 和 miR-224 的表現量在癌症前期就開始異常上升， 其中 miR-216a 的上升現象在男性病患尤其顯著。 後續針對 miR-216a 進行研究性別差異的原因， 結果發現雄激素訊息傳遞路徑會促進肝癌細胞內生性的 pri-miR-216a 表現量， 而且此現象在 B 型肝炎病毒的 X 蛋白 (HBx) 存在下會更加明顯。 利用 5’ RACE 找出 pri-miR-216a 5’ 上游可能之轉錄起始位置 (Transcriptional Starting Site；TSS)， 針對此 TSS 構築數個包含 TSS 上游不同長度之 reporter 質體， 界定 TSS 上游 –603 到 –304 bp 之基因片段為接受雄激素調控之區域。 進一步利用點突變的實驗確認 –349 到 –335 bp 之間的雄激素反應序列 (androgen response element；ARE) 是 AR 調控轉錄的重要關鍵位置。 之後利用染色質免疫沉澱分析 (Chromatin immunoprecipitation；ChIP) 進一步證實受 ligand 刺激的 AR 的確會與 promoter 上的這個 ARE 作結合， 進而去促進 miR-216a 的轉錄。 除了 miR-216a 的上游調控機轉發現外， 我們也發現 miR-216a 會與 TSLC1 抑癌基因的 3’ 端未轉譯區 (3’ untranslated region；3’ UTR) 結合而降低 TSLC1 蛋白質的表現， 進而去促進肝細胞的增生和遷移之活性。 最後分析臨床上男性病患的肝臟組織， 發現從肝癌前期到演變成肝癌的過程， AR 蛋白表現量會增加， 伴隨著 miR-216a 表現上升及 TSLC1 表現下降， 具顯著相關。 本研究因此指出一雄激素訊息傳遞路徑促進 miR-216a 之轉錄進而降低抑癌基因 TSLC1 表現之調控機轉， 對於肝癌形成早期提供了一個新穎的分子機制。

Deregulation of microRNAs (miRNAs) is common in advanced human hepatocellular carcinomas (HCC); however, the ones involved in early carcinogenesis have not yet been investigated. By examining the expression of 22 HCC-related miRNAs between precancerous and cancerous liver tissues, we found miR-216a and miR-224 were significantly upregulated, starting from the precancerous stage. Furthermore, the elevation of miR-216a was mainly identified in male patients. To study this gender difference, we demonstrated that pri-miR-216a is activated transcriptionally by the androgen pathway in a ligand-dependent manner and is further enhanced by the hepatitis B virus X protein. The transcription initiation site for pri-miR-216a was delineated, and one putative androgen responsive element site was identified within its promoter region. Mutation of this site abolished the elevation of pri-miR-216a by the androgen pathway. One target of miR-216a was shown to be the TSLC1 tumor suppressor mRNA through the three target sites at its 3’ UTR. Finally, the androgen receptor level increased in male liver tissues during hepatocarcinogenesis, starting from the precancerous stage, with a concomitant elevation of miR-216a but a decrease of TSLC1. Conclusion: The current study discovered the upregulation of miRNA-216a by the androgen pathway and a subsequent suppression of TSLC1 as a new mechanism for the androgen pathway in early hepatocarcinogenesis.