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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 沈立言(Lee-Yan Sheen) | |
dc.contributor.author | Yung-Lin Chu | en |
dc.contributor.author | 朱永麟 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-16T08:29:39Z | - |
dc.date.available | 2019-01-27 | |
dc.date.copyright | 2014-01-27 | |
dc.date.issued | 2014 | |
dc.date.submitted | 2014-01-08 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/58762 | - |
dc.description.abstract | 大蒜是一種歷史悠久的食物與藥物,其主要活性成分為大蒜素(Allicin),可從新鮮的大蒜破碎而取得,然而大蒜素具有對光、熱敏感的特性且容易降解成為diallyl sulfide、diallyl disulfide與diallyl trisulfide,故必須儲存在低溫的環境下。目前肝癌病患在台灣的癌症死亡率位居第二名,儘管有許多研究指出大蒜對於癌症有很好的治療效果,但目前針對大蒜對肝癌治療的相關研究並不明確。在本研究中,我們將著重於探討大蒜素經由p53之調控,誘導Hep G2(p53wild type)與Hep 3B(p53mutation)細胞產生不同細胞死亡模式。實驗結果顯示大蒜素不僅可以誘導Hep G2 cells產生p53所調控之自體吞噬性死亡,亦導致Hep 3B細胞產生細胞凋亡。由西方墨點法可以觀察到大蒜素降低了Hep G2細胞質中的p53、PI3K/AKT與mTOR等蛋白質的表現量;同時增加了AMPK/TSC2與LC3-II等訊息傳遞路徑蛋白質的表現。此外,利用共軛焦顯微鏡觀察之結果顯示,大蒜素造成Hep G2細胞吞噬小體之形成以及p53、AIF與Endo G蛋白質在Hep G2與Hep 3B細胞內的表現與分布。然而大蒜素也可誘導Hep 3B細胞產生大量ROS,進而造成DNA損傷、粒線體膜電位下降、活化caspase依賴性與非依賴性凋亡途徑造成細胞凋亡。進一步利用了siRNA-TP53使Hep G2細胞的p53表現量降低,再將大蒜素添加於細胞培養液中,發現Hep G2細胞產生細胞凋亡之現象,此結果與Hep 3B細胞之結果相同。綜合以上實驗,證明大蒜素的確能誘導人類肝癌細胞產生細胞凋亡或自體吞噬性死亡,且對於具細胞凋亡抗性的肝癌細胞可能具有輔助性基因治療的潛力。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Garlic has been used throughout history for both culinary and medicinal purpose. Allicin is a major component of crushed garlic. Although it is sensitive to heat and light, and easily degraded into various compounds such as diallyl sulfide, diallyl disulfide, and diallyl trisulfide, allicin is still a major bioactive compound of crushed garlic. Hepatocellular carcinoma is the top two causes of cancer-related death in Taiwan. Although numerous studies have shown the cancer preventive properties of garlic and its components, there is no study on the effect of allicin on the growth of human liver cancer cells. In this study, we focused on allicin-induced different modes of cell death in human liver cancer Hep G2 (p53wild type) and Hep 3B (p53mutation) cells through p53-regulation. Our results indicated that allicin induced p53-mediated autophagic cell death in Hep G2 cells and caused Hep 3B cells apoptosis. Using western blotting, we observed that allicin decreased the level of cytoplasmic p53, PI3K/mTOR signaling pathway, Bcl-2 and increased the expression of AMPK/TSC2, and LC3-II signaling pathways in Hep G2 cells. In addition, the image of LC3-II punctate with mitotracker-red (labeling mitochondria) resulting in allicin-induced Hep G2 cells autophagosome formation and the protein expression of p53, AIF and Endo G in Hep G2 and Hep 3B cells could be observed by confocal laser microscope. On the other hand, allicin could induce ROS production in Hep 3B cells, caused DNA damage, decreased mitochondria membrane potential (ΔΨm) and activated caspase-dependent and -independent apoptosis pathways. To gain insight into the cell death mechanism in p53 knocked down Hep G2, we silenced p53 gene using siRNA mediated silencing. Allicin treatment induced apoptotic cell death in p53 knocked down Hep G2 cells similar to that of Hep 3B cells. These results suggest that allicin induced cell death in human hepatoma cells either through autophagy or apoptosis and might be a potential novel complementary gene therapeutic agent for the treatment of apoptosis resistant cancer cells. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-16T08:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-103-D98641004-1.pdf: 10844255 bytes, checksum: b9e6f31a5b89ffa420b3c932b95e7035 (MD5) Previous issue date: 2014 | en |
dc.description.tableofcontents | 目錄
中文摘要……………………………………………………………………… I 英文摘要……………………………………………………………………… II 目錄…………………………………………………………………………… IV 圖表次……………………………………………………………………… 縮寫目錄………………………………………………………………… VII XI 第一章、緒論…………………………………………………………………… 1 第二章、文獻回顧……………………………………………………………… 2 第一節、肝臟……………………………………………………………... 2 一、肝臟生理功能…………………………………... 2 二、常見肝臟疾病………………………………………………... 5 第二節、癌症…………………………………………………………... 7 一、癌症生成原因及過程…………………………………………... 7 二、癌細胞的特性…………………………………………………... 8 三、肝癌的種類………………………………………..13 四、引起肝癌的主要因子…………………………………………….14 五、常見肝癌的治療方法………………………………………16 第三節、細胞死亡機制……………………………………………………...17 一、肝癌與細胞死亡………………………………………………..17 二、細胞凋亡(apoptosis)相關途徑與機制………………………..18 三、細胞自體吞噬(autophagy)機制……………………………..31 第四節 大蒜………………………………………………………………38 一、基本介紹……………………………………………………38 二、生理活性………………………………………………………. 40 三、大蒜素安定性……………………………………………………. 42 三、大蒜素安定性……………………………………………………. 42 第三章、研究目的與實驗架構……………………………………………… 43 第一節、試驗假說………………………………………………………..... 43 第二節、研究目的………………………………………………………..... 44 第三節、實驗架構………………………………………………………..... 45 一、試驗設計………………………………………………………..... 46 二、免疫缺陷小鼠之皮下誘導肝癌模式……………………………... 47 (一)實驗架構…………………………………………………… 47 (二)實驗流程…………………………………………………… 48 三、細胞死亡機制之探討…………………………………………… 49 (一)實驗架構…………………………………………………… 49 (二)實驗流程…………………………………………………… 50 四、大蒜素安定性試驗模式………………………………………… 51 (一)實驗架構…………………………………………………… 51 (二)實驗流程…………………………………………………… 53 第四章、材料與方法…………………………………………………………… 54 第一節、材料製備……………………………………………………... 54 一、細胞株來源…………………………………………………... 55 二、藥品試劑………………………………………………………... 56 三、儀器設備與器材…………………………………………… 60 第二節、實驗方法………………………………………………………... 62 一、大蒜素(allicin)藥物配製………………………………………... 62 二、肝癌細胞株Hep G2與Hep 3B細胞培養………………………... 64 三、細胞冷凍保存與活化………………………………………… 64 四、細胞存活率(Cell viability)之分析……………………………… 65 五、細胞週期(Cell cycle)之分析……...……………………… 67 六、活性氧化物質(ROS)分析……………………………… 69 七、細胞核質濃縮現象觀察DAPI螢光染色……………………… 70 八、粒線體膜電位…………………………………………… 71 九、檢測細胞內鈣離子(Ca2+)釋出的變化……………………… 72 十、西方墨點法(Western blotting)……………………………… 74 十一、免疫螢光染色………………………………………………… 80 十二、Annexin V-FITC/PI雙染試驗………………………………… 81 十三、Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) 83 十四、siRNA-p53轉殖技術……..…………………………………… 84 十五、HPLC分析試驗……………………………………………… 84 十六、GC分析試驗………………………………………………… 85 十七、動物實驗結果之分析………………………………………… 86 十八、統計分析(Statistics analysis)………………………………… 86 第五章、實驗結果……………………………………………………………… 87 第一節、合成與純化大蒜素之成果…………………………………... 87 第二節、評估大蒜素是否能有效抑制Hep 3B肝癌細胞生成腫瘤之動物實驗模式………………………………………………………… 88 第三節、評估大蒜素誘導Hep 3B細胞死亡之機制探討…………… 89 第四節、評估大蒜素誘導Hep G2細胞死亡之機制探討…………… 94 第五節、評估大蒜素安定性試驗…………………………………… 99 第六章、討論………………………………………………………………… 101 第七章、結論………………………………………………………………… 118 第八章、實驗結果與圖表…………………………………………………… 122 第九章、參考文獻…………………………………………………………… 168 附錄…………………………………………………………………………… 188 圖表次 Figure 2-2-1. The p450 catalytic cycle…………………………………… 4 Figure 2-2-1. 癌症發展過程中之六大特徵………………………………… 9 Figure 2-2-2. 發炎反應為癌症發展過程中之七大特徵…………………… 10 Figure 2-2-3. 腫瘤內微環境………………………………………………… 11 Figure 2-2-4. 行政院衛生署2012年國人十大癌症死因…………………… 12 Figure 2-3-1. 粒線體MPTP組成結構示意圖……………………………… 21 Figure 2-3-2. 死亡受器與其配體以及相關連接蛋白……………………… 22 Figure 2-3-4. 內質網壓力下,未摺疊蛋白反應(unfolded protein respone)相關訊息傳導路徑………………………………………… 24 Figure 2-3-5. 胞內鈣離子與細胞死亡之關係圖…………………………… 25 Figure 2-3-6. 鈣離子對細胞週期相關蛋白的影響………………………… 26 Figure 2-3-6A. 細胞中ROS量之閾值……………………………………… 32 Figure 2-3-7. 四種自體吞噬模式…………………………………………… 34 Figure 2-3-8. 利用自體吞噬作用治療癌症之可能策略…………………… 36 Figure 2-3-9. p53與自體吞噬之相關訊息傳導圖…………………………… 39 Figure 2-3-10. 大蒜中硫化物轉換生合成圖………………………………… 41 Figure 2-3-11. Designer Food Program,NCI,2005……………………… 42 Figure 4-1-1. 大蒜素合成步驟圖……………………………………..……… 57 Figure 4-2-1. 大蒜素濃度比較表……………………………..……………… 65 Figure 4-2-2. 大蒜素濃度配製表……………………………..……………… 65 Figure 4-4-1. 流式細胞儀存活率分析圖………………………..…………… 68 Figure 4-5-1. 流式細胞儀細胞週期分析圖……………………..…………… 69 Figure 4-5-2. Cell cycle PI染劑配製………………………………………… 70 Figure 4-6-1 流式細胞儀ROS螢光分析圖………………...………………… 71 Figure 4-8-1. 流式細胞儀偵測粒線體膜電位分析圖……………………… 74 Figure 4-9-1. 流式細胞儀偵測粒鈣離子濃度分析圖……………………… 75 Figure 4-10-1A. BSA之配製………………………………………………… 77 Figure 4-10-1B. BSA標準曲線分析圖……………………………………… 77 Figure 4-10-2. SDS-PAGE下層膠 (Separation gel)之配製及組成………… 79 Figure 4-10-3. SDS-PAGE上層膠 (Stacking gel)之配製及組成…………… 80 Figure 4-10-4. Running buffer (1.5M Tris-HCl, pH=8.8) ………………… 80 Figure 4-10-5. Stacking buffer (0.5 M Tris-HCl, pH=6.8) …………………….. Figure 4-10-6. 電泳緩衝液(Running buffer)之組成………………………… 80 81 Figure 4-10-7. 轉印緩衝液 (Transfer buffer)之組成………………………… 81 Figure 4-10-8. PBS-tween 20 (PBST)之組成………………………………… 81 Figure 4-12-1. 壞死與凋亡細胞之掃描式電子顯微鏡之細胞表面圖………. 84 Figure 4-12-2. Annexin V-FITC/PI試驗結果判讀圖………………………… 84 Figure 8-1-1A. 大蒜抑制Hep 3B細胞生長之動物實驗 (morphology)……. 122 Figure 8-1-1B. 動物實驗腫瘤大小量化圖…………………………………… 122 Figure 8-1-1C. 動物實驗之老鼠體重量化圖………………………………… 122 Figure 8-2-1. 處理不同濃度大蒜素對人類肝癌細胞株Hep 3B之24小時細胞型態圖……………………………………………………………………… 124 Figure 8-2-2. 不同濃度大蒜素處理Hep 3B細胞24小時之存活率量化圖… Figure 8-2-3. 處理不同濃度大蒜素對Hep 3B細胞24小時之細胞週期分布圖與量化表…………………………………………………………………… 125 126 Figure 8-2-4. 在不同時間點以annexin V-FITC/PI雙染試驗來觀察大蒜素是否造成Hep 3B細胞產生凋亡之現象……………………………………… 128 Figure 8-2-5. 處理大蒜素誘導Hep 3B細胞內產生大量活性氧化物質…… 129 Figure 8-2-6. 不同濃度大蒜素處理24小時對Hep 3B細胞造成染色體核質濃縮現象……………………………………………………………………… 130 Figure 8-2-7. 處理35 μM大蒜素1, 3與6小時顯著地降低Hep 3B細胞粒線體膜電位…………………………………………………………………… 131 Figure 8-2-8. 以流式細胞儀來觀察細胞內鈣離子濃度…………………… 132 Figure 8-2-9. 以西方墨點法來觀察大蒜素處理後誘導Hep 3B細胞產生內質網傷害之重要生物指標蛋白表現量……………………………………… 133 Figure 8-2-10. 以西方墨點法來觀察細胞凋亡中與粒線體相關之重要蛋白質表現量……………………………………………………………………….. 134 Figure 8-2-11A. 以西方墨點法來觀察細胞凋亡中重要的caspase-3, -8, -9之蛋白質表現量….............................................................................................. 135 Figure 8-2-11B. 以qRT-PCR觀察caspase-3與AIF之mRNA表現量………. 135 Figure 8-2-12A. 以共軛焦顯微鏡觀察處理35 μM大蒜素24小時造成Hep 3B細胞內Endo G蛋白質轉位至細胞核之現象…………………………… 137 Figure 8-2-12B. 以共軛焦顯微鏡觀察處理35 μM大蒜素24小時造成Hep 3B細胞內AIF蛋白質轉位至細胞核之現象………………………………… 138 Figure 8-2-13. 以免疫螢光染色法來觀察大蒜素是否造成Hep 3B細胞DNA雙股斷裂傷害,以及使用西方墨點法來觀察在處理大蒜素不同時間點中γ-H2AX之蛋白質表現量………………………………………………… 139 Figure 8-2-14. 預處理5 mM NAC(ROS抑制劑)三小時確實成功減少了大蒜素所毒殺的Hep 3B細胞數,同時也在蛋白質層次顯著的抑制了大蒜素所誘導的casapse-3與AIF等凋亡蛋白質的表現………………………… 141 Figure 8-2-15. 大蒜素誘導Hep 3B細胞走向細胞凋亡之建議機制圖……… 142 Figure 8-3-1. 大蒜素對人類肝癌細胞株Hep G2細胞之存活率與細胞型態之影響………………………………………………………………………… 144 Figure 8-3-2. Hep G2細胞經大蒜素處理後細胞凋亡與壞死之區分圖…… Figure 8-3-3. 處理大蒜素35 μM誘導Hep G2細胞型成胞內空泡化與吞噬小體之形成…………………………………………………………………… 146 147 Figure 8-3-4 (A and B). 利用西方墨點法來觀察處理35 μM大蒜素是經由53/AMPK與PI3K/Akt途徑造成Hep G2細胞形成自體吞噬性死亡……… 149 Figure 8-3-4C. 使用共軛焦顯微鏡觀察p53在細胞核與細胞質之分佈情況. 150 Figure 8-3-5. 以西方墨點法來觀察35 μM大蒜素處理Hep G2細胞之粒線體相關蛋白質與自體吞噬和細胞凋亡之間的關係………………………… 152 Figure 8-3-6. 以免疫螢光染色法觀察大蒜素處理後造成Hep G2細胞中粒線體膜電位改變與吞噬小體吞沒粒線體之現象…………………………… 154 Figure 8-3-7. 預處理 2 mM 3-MA(3-methyladenine)兩小時可抑制大蒜素在Hep G2細胞所誘導的自體吞噬作用…………………………………… 156 Figure 8-3-8. 預處理siRNA-TP53對Hep G2細胞之影響。(A) Annexin V-FITC/PI雙染試驗之結果與量化圖。(B) 蛋白質表現量之結果圖…...…… 159 Figure 8-3-9. 大蒜素經由p53調節肝癌細胞走向細胞凋亡或自體吞噬之建議機制圖……………………………………………………………………….. 160 Figure 8-3-10. (A) 大蒜素之HPLC分析圖。(B) 大蒜素之LC/MS/MS圖….. 161 Figure 8-3-11. 大蒜素在純細胞培養液中不同時間點之HPLC圖(不含Hep3B細胞)...................................................................................................... 163 Figure 8-3-12. 大蒜素在含有Hep 3B細胞的細胞培養液之HPLC圖……… 164 Figure 8-3-13. 大蒜素在純細胞培養液中不同時間點之GC-FID圖……….. 165 Figure 8-3-14. 大蒜素在細胞中之培養不同時間點的GC-FID圖(已移除細胞培養液)........................................................................................................ 166 Figure 8-3-15. 大蒜素在細胞培養液中培養不同時間點之GC-FID圖(已移除Hep 3B細胞)…………………………………………………………… 167 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 大蒜素有效抑制動物實驗中肝癌腫瘤之生長且可經由p53調控人類肝癌細胞株誘導產生不同死亡模式之機制研究 | zh_TW |
dc.title | Allicin Inhibits the Tumor Growth in vivo and Induces Different Modes of Cell Death via p53 Modulating in Human Liver Cancer Cell Lines | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 102-1 | |
dc.description.degree | 博士 | |
dc.contributor.coadvisor | 何其儻(Chi-Tang Ho),鍾景光(Jing-Gung Chung) | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 李宗貴(Chong-Kuei Lii),吳焜裕(Kuen-Yuh Wu),羅翊禎(Yi-Chen Lo) | |
dc.subject.keyword | 大蒜素,p53,自體吞噬,LC3-II,人類肝癌細胞株, | zh_TW |
dc.subject.keyword | allicin,p53,autophagy,LC3-II,human liver cancer cells, | en |
dc.relation.page | 190 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2014-01-08 | |
dc.contributor.author-college | 生物資源暨農學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 食品科技研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 食品科技研究所 |
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