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標題: | 山羊 ß-酪蛋白近端起動子與第一內含子於不朽化山羊乳腺上皮細胞株之功能性研究 Functional study of proximal goat ß-casein promoter and intron 1 in immortalized caprine mammary epithelial cells |
作者: | Ming-Hsiang Kung 龔明祥 |
指導教授: | 朱有田,姜延年 |
關鍵字: | 山羊,乳腺上皮細胞,&szlig,-酪蛋白起動子,第一內含子,泌乳素, goat,mammary epithelial cell,&szlig,-casein promoter,intron 1,prolactin, |
出版年 : | 2015 |
學位: | 博士 |
摘要: | 山羊 ß-酪蛋白起動子被廣泛應用於轉基因山羊中驅動重組醫藥蛋白的表現,然而,山羊 ß-酪蛋白起動子活性受泌乳激素調控之順式作用元件與反式作用因子的研究,目前仍然缺乏在山羊乳腺上皮細胞中進行研究的直接證據;因此,本研究使用不朽化山羊乳腺上皮細胞株(CMC)作為研究平台,進一步證實泌乳激素刺激山羊 ß-酪蛋白基因轉錄作用之分子調控機制。
為了研究山羊 ß-酪蛋白起動子至第一內含子(–4,047 至 +2,054)受泌乳激素調控的順式作用元件,本研究首先建構了數個以山羊 ß-酪蛋白基因5’ 端側區系列刪除的起動子與有或無第一內含子序列驅動螢火蟲冷光素酶報導基因之重組質體,並利用雙重冷光系統分析在CMC細胞中之起動子活性變化。研究結果指出,所有不同長度的起動子重組質體活性受到泌乳素活化,而所有的起動子活性對泌乳素與氫皮質酮之協同作用具有加乘作用,其中 –1.68 kb之山羊 ß-酪蛋白起動子序列內即具有可受泌乳激素誘導活化的調控元件,然而,起動子包含第一內含子序列會顯著降低起動子的基礎活性,此抑制作用並不會受泌乳激素刺激而減輕,經由第一內含子3’ 端系列刪除的研究猜測此抑制作用元件可能位於 +393 至 +501的區域,這個發現有別於過去其他物種的研究。 本研究使用CMC細胞與數個專一性訊息抑制劑研究3條訊息傳導途徑在泌乳激素刺激 –1.68 kb山羊 ß-酪蛋白起動子活性的角色,經由處理AG490抑制劑研究發現,Janus kinase 2/訊息傳導及轉錄活化因子 5a(signal transducer and activator of transcription 5a,STAT5a)訊息傳導途徑在泌乳素刺激起動子活性作用扮演一個重要的角色,而同時添加氫皮質酮會提升並延長STAT5a與山羊 ß-酪蛋白起動子之活性;然而,在兩種泌乳激素同時添加的CMC細胞中,當分別處理抑制劑PD98059與LY294002分別抑制mitogen/extracellular signal-regulated kinase/extracellular signal-regulated protein kinase與phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B訊息傳導途徑會導致山羊 ß-酪蛋白起動子活性STAT5a磷酸化程度的上升;這些結果指出,山羊 ß-酪蛋白起動子活性受到這些訊息傳導途徑的調控,而轉錄因子STAT5a是主要的調節者。 為了分析受泌乳激素刺激活化所需的最小片段長度之山羊 ß-酪蛋白起動子,以 –1.68 kb 山羊 ß-酪蛋白起動子建構數個5’ 端側區DNA系列刪除的起動子重組質體進行分析研究,結果指出重要的順式作用元件位於山羊 ß-酪蛋白起動子的近端位置(–300 至 –90),而此新發現的山羊近端起動子功能並不存在於牛和人類的起動子中。另外,為了確認在 –1.68 kb起動子預測的STAT5a結合位置與醣皮質素受體反應元件之角色,以內部刪除突變與STAT5a結合位置的單一核苷酸定點突變,證實了一個STAT5a結合位置(–102 至 –82)與其中 –90鳥苷酸(guanosine)序列保留性對泌乳激素作用的重要性,並以染色質免疫沉降分析法進一步確認STAT5a與該序列受泌乳激素刺激的結合作用;另外也發現,泌乳激素的誘導作用並不需要依賴醣皮質素受體反應元件。 綜合以上的發現證實了 –300 bp的近端山羊 ß-酪蛋白起動子包含了一個可反應泌乳激素刺激作用的STAT5a結合位置(–102 至 –82),另外,第一內含子也許是山羊乳腺組織或發育時期專一表現所必需的調節序列。 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/54761 |
全文授權: | 有償授權 |
顯示於系所單位: | 動物科學技術學系 |
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