重組地衣芽孢桿菌鹼性絲胺酸蛋白酶之特性及其於米蛋白之應用

Abstract

微生物鹼性絲胺酸蛋白酶廣泛應用於食品業、洗滌業及飼料業，又以 Bacillus sp. 所產之枯草桿菌蛋白酶最為重要。本研究成功將 Bacillus licheniformis ATCC 14580 之鹼性絲胺酸蛋白酶基因 (apr) 選殖於 Escherichia coli 中，此序列全長為 1,140 bp，具 379 個胺基酸。經胺基酸序列比對後，與 subtilisin Carlsberg 具高度同源性，因此，推測 apr 亦為 pre-pro-mature 之酵素結構。透過選殖去除本身 pre-peptide，為 pro-mature-peptide 之 aprO 及僅含 mature peptide 之 aprM 於表現載體 pET-22b(+)，並轉型至 E. coli BL21 (DE3)。依據 SDS-PAGE、Western blot、蛋白酶活性測試及質譜定序之結果，可知 pro-peptide 為蛋白酶形成活性結構之必要片段。將 E. coli BL21 pET-22b-aprO 之粗萃液純化後，可得具有活性且分子量約為 28.4 kDa 之重組蛋白 rHis-aprO。rHis-aprO 之最適溫度及 pH 值為 60℃ 及 pH 10，並於 50℃ 下具熱安定性及中、鹼性環境仍保持穩定活性。rHis-aprO 之蛋白酶活性會受 phenylmethylsulfonyl fluoride 影響而所抑制，判定其為一絲胺酸蛋白酶。另外，rHis-aprO 之活性會被 5 mM Ca2+、Mn2+ 及 Mg2+ 所提升，且於界面活性劑、ethylenediaminetetraacetic acid 及多種有機溶劑中具安定性。rHis-aprO 可水解牛血清白蛋白、酪蛋白、膠原蛋白及米蛋白。且 rHis-aprO 於米蛋白之水解率可達 11%。因此，rHis-aprO 具有應用於生產米蛋白水解物之潛力。