山羊第五型類胰島素生長因子結合蛋白於乳腺細胞之功能研究

Abstract

類胰島素生長因子 (insulin-like growth factors, IGFs) 在哺乳類動物生理和發育中扮演著重要的角色，調控細胞的生長、分化和凋亡。其生化活性受到與其具有高親和力結合蛋白 (insulin-like growth factor binding proteins, IGFBPs) 的影響。在小鼠乳腺中，第五型類胰島素結合蛋白 (IGFBP-5) 於退乳時期會大量表現，藉由與IGFs的結合抑制下游驅動的細胞存活訊息，同時與tissue plasminogen activator (t-PA) 作用活化plasminogen成為plasmin，促進小鼠乳腺退乳。由於IGFBP-5於乳腺各時期及物種間的表現量並不相同，其功能也不盡相同。而IGFBP-5在山羊乳腺中所扮演的角色尚未明瞭，此研究之目的想探討山羊IGFBP-5對於不朽化山羊乳腺細胞株 (caprine mammary cell, CMC) 的影響。 首先，從山羊乳腺初級培養細胞當中將山羊IGFBP-5的cDNA選殖出來，將其轉譯出的胺基酸序列與其他物種做比對，在山羊、綿羊、牛、豬、人類、小鼠與大鼠間，相似度非常高。進一步將山羊IGFBP-5的cDNA架接至可於哺乳類動物細胞表現的載體上，轉染至CMC後，利用免疫螢光染色分析，山羊IGFBP-5主要表現在細胞質，且與內質網 (ER) 和高基氏體 (Golgi) 座落在相同的位置。為測定山羊IGFBP-5對於β-酪蛋白基因啟動子活性的影響，將山羊β-酪蛋白基因啟動子架接至具有螢火蟲冷光素酶基因之質體，另外將thymidine kinase 啟動子架接至具有珊瑚蟲冷光素酶基因之質體上，矯正細胞轉型效率，將上述兩個質體與山羊IGFBP-5 共同轉染至CMC，經泌乳素刺激後48 小時，利用雙重冷光酶系統分析β-酪蛋白基因啟動子之活性，發現外源性表現山羊IGFBP-5 於CMC 能降低由泌乳素誘導山羊β-酪蛋白基因啟動子之活性倍數。 為了克服細胞轉型效率不同的問題，利用pET system 表現山羊IGFBP-5 重組蛋白。首先將山羊IGFBP-5 架接至pET 質體中，並轉型至大腸桿菌宿主BL21(DE3)。利用IPTG 誘導山羊IGFBP-5 重組蛋白的表現，於添加後5 小時表現量最高，隨後以lysozyme和超音波震盪的方式破菌獲得粗萃的蛋白質，進一步利用Ni-NTA His Bind Resin 純化目標山羊IGFBP-5 重組蛋白，並找出純化最佳條件 [4 mL 粗萃蛋白與1 mL resin 結合反應1 小時，將混合物移入column 中，依序以4 mL Wsh Buffer(20 mM imidazole) 清洗column 1 次， 1 mL Wsh Buffer (40 mM imidazole) 清洗columnn 4 次。1 mL Wsh Buffer (50 mM imidazole) 清洗columnn 3 次。滴完後以0.5 mL Elute Buffer (80 和250 mM imidazole) 濾出目標山羊IGFBP-5 重組蛋白各4次]。純化的山羊IGFBP-5 重組蛋白以西方吸漬法分析，分子量約為34 kDa，且山羊IGFBP-5 重組蛋白可抑制由IGF-1 所誘導的下游Akt 磷酸化的情形，證實所產製出的山羊IGFBP-5 重組蛋白具有生化活性。 將山羊乳腺初級培養細胞和CMC，培養在富含胞外基質的Matrigel 當中，細胞會體外形成3D 的乳腺泡 (acini)，於培養過程同時添加山羊IGFBP-5 重組蛋白(10 nM、100 nM)，培養10 天後發現處理組的乳腺泡形成的數量較少，乳腺泡大小也比較小，經由螢光染色觀察後發現處理組的空腔形成情況並不明顯。 本試驗證實山羊IGFBP-5 會抑制泌乳素對於β-酪蛋白基因啟動子之活性的調控。此外，利用pET system 表現並純化重組的山羊IGFBP-5 蛋白，初步證明此蛋白具有生化活性，處理體外3D 培養的細胞，會影響乳腺泡的形成和大小。未來可更進一步利用重組的山羊IGFBP-5 來探討IGFBP-5 於乳腺發育過程中所可能扮演的角色及其所參與之分子機制。