微核醣核酸於沙門氏菌感染宿主細胞之角色探討

Abstract

沙門氏菌(Salmonella)是一種革蘭氏陰性桿菌，屬於腸內菌(Enterobacteriaceae)之一屬。主要可造成急性腸炎、菌血症以及傷寒 (Typhoid fever) 、副傷寒(Paratyphoid fever)等疾病。其感染來源可透過食入汙染的食物與水或是接觸受感染的動物，是食物中毒主要原因之一。 微核醣核酸(microRNAs)是大約21-24nt的non-coding RNA。可以在轉錄後層級(post-transcription level)調控基因的表現。近年來有許多研究指出，微核醣核酸在Host-pathogen interaction也就是宿主細胞抵禦微生物感染當中扮演著相當重要的角色。此外，微核醣核酸與宿主細胞的Innate immunity的調控亦有著重要的關聯。 在此研究中，我們採用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium) 與人類腸道上皮細胞株(HT-29)為感染實驗模組，欲探討當HT-29細胞受沙門氏菌感染時，腸道上皮細胞本身微核醣核酸之調控以及表現量的差異，並期望找出對於細菌在細胞中複製或與宿主細胞之存活和凋亡有影響力的微核醣核酸，甚至進一步找出這些重要的微核醣核酸的目標基因。 實驗過程中，為了找尋細胞感染時最適當的表現型 (phenotype)，嘗試了細胞存活檢測（MTT cell viability assay）、乳酸去氫酶分析法 (Lactate dehydrogenase assay；LDH assay).、流式細胞儀 (Flow Cytometer)、免疫螢光染色(Immunofluorescent stain)以及細胞內細菌複製曲線 (intracellular growth)等方法。最後以細菌在細胞內的複製曲線為主要研究的表現型，並收集未感染以及感染後 4、16與24小時 等三個時間點的HT-29細胞RNAs，運用TLDA (TaqMan Low Density Array)分析微核醣核酸表現圖譜。 由TLDA之結果，並以qRT-PCR進行再次確認，挑出了四個感染前後表現有顯著差異的微核醣核酸 (hsa-miR-125b、hsa-miR-545、hsa-miR-210以及hsa-miR-146a)，並建構此四個微核醣核酸的表現質體 (p-silencer)並挑選穩定表現此四個微核醣核酸之HT-29 細胞株。在可大量表現這四個微核醣核酸之HT-29細胞株，進行細菌感染實驗，觀察細胞內細菌複製曲線(intracellular growth)的改變。此外，我們運用網路上的軟體預測出DUSP1 (MKP-1)可能為miR-545之目標基因，並且由基因表現晶片及qRT-PCR之實驗結果發現感染16小時及24小時後的DUSP1 mRNA 表現量，明顯地較未感染及感染後4小時下降許多。因此，我們推測，當鼠傷寒沙門氏菌感染宿主細胞時，沙門氏菌使宿主細胞調控miR-545，使miR-545表現量上升，有可能因此而抑制DUSP1的表現，使得鼠傷寒沙門氏菌得以在細胞內複製。