溶酶體內轉譯後加工切割與N-醣基化作用對豬第二型去氧核醣核酸水解酶之重要性

Abstract

由豬脾臟純化而得的乙型去氧核糖核酸酶 (porcine spleen DNase II)，簡稱為pDNase II，為一酸性DNA水解酶，具有α1、β及α2 三個包含於同一cDNA之次單元體，連接α1、β與β、α2間的連接肽鏈可能是藉轉譯後修飾作用而切除方形成pDNase II之三次元體結構。為探討轉譯後加工切除與pDNase II間的關聯性，我們利用暫時性轉染將載有pDNase II cDNA的表現質體 (pDNaseII)送入人類胚胎腎臟293T細胞 (HEK 293T cells)中表現重組pDNase II (rpDNase II)。在細胞萃取物中可見35、11.5以及46.5 kDa的蛋白質訊號，但在細胞培養液中僅見46.5 kDa的蛋白質訊號。在培養液中偵測到的46.5 kDa蛋白質藉由Cibacron Blue以及Mini-S管柱層析純化至均質並分析特徵。MALDI-TOF質譜儀和胺基酸定序的結果顯示此46.5 kDa蛋白質為具有單一多肽鏈的pDNase II。46.5 kDa的rpDNase II可於活性膠體染色分析中顯示酸性水解酶之酵素活性且比活性約為pDNase II的兩倍。轉染pcDNaseII的人類胚胎腎臟293T細胞經溶酶體抑制劑chloroquine處理後會造成46.5 kDa蛋白質訊號增加與35 kDa蛋白質訊號的減少。而以蛋白質生合成抑制劑cycloheximide處理人類胚胎腎臟293T細胞後，46.5 kDa的蛋白質訊號會逐漸消失且35kDa蛋白質訊號會增加。由以上結果可知rpDNase II的轉譯後加工切除發生於溶酶體中，且轉譯後加工切除並不參與pDNase II活化過程。 pDNase II具有六個N-醣基化位置，分別是Asn72、Asn88、Asn171、Asn214、Asn268與Asn292，我們利用定位點突變的方式將此六個天門冬醯胺 (asparagine)殘基分別突變成麩醯胺酸 (glutamine)，再將構築完成的突變株以暫時轉染方式送入人類胚胎腎臟293T細胞表現突變重組蛋白質，此六個突變蛋白質的酵素活性並不因點突變而有大幅減少，另外，經b-N-Acetylglucosaminidase H去除所攜帶醣基的rpDNase II，仍可在活性染色膠體上顯示活性。