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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/41248
標題: | 溶酶體內轉譯後加工切割與N-醣基化作用對豬第二型去氧核醣核酸水解酶之重要性 The Significance of Lysosomal Post-translational Processing and N-glycosylation for Porcine Deoxyribonuclease II |
作者: | Ru-Ting Huang 黃如婷 |
指導教授: | 廖大修(Ta-Hsiu Liao),呂紹俊(Shao-Chun Lu) |
關鍵字: | 去氧核醣核酸水解酶,轉譯後加工切割, Deoxyribonuclease II,post-translational processing, |
出版年 : | 2009 |
學位: | 博士 |
摘要: | 由豬脾臟純化而得的乙型去氧核糖核酸酶 (porcine spleen DNase II),簡稱為pDNase II,為一酸性DNA水解酶,具有α1、β及α2 三個包含於同一cDNA之次單元體,連接α1、β與β、α2間的連接肽鏈可能是藉轉譯後修飾作用而切除方形成pDNase II之三次元體結構。為探討轉譯後加工切除與pDNase II間的關聯性,我們利用暫時性轉染將載有pDNase II cDNA的表現質體 (pDNaseII)送入人類胚胎腎臟293T細胞 (HEK 293T cells)中表現重組pDNase II (rpDNase II)。在細胞萃取物中可見35、11.5以及46.5 kDa的蛋白質訊號,但在細胞培養液中僅見46.5 kDa的蛋白質訊號。在培養液中偵測到的46.5 kDa蛋白質藉由Cibacron Blue以及Mini-S管柱層析純化至均質並分析特徵。MALDI-TOF質譜儀和胺基酸定序的結果顯示此46.5 kDa蛋白質為具有單一多肽鏈的pDNase II。46.5 kDa的rpDNase II可於活性膠體染色分析中顯示酸性水解酶之酵素活性且比活性約為pDNase II的兩倍。轉染pcDNaseII的人類胚胎腎臟293T細胞經溶酶體抑制劑chloroquine處理後會造成46.5 kDa蛋白質訊號增加與35 kDa蛋白質訊號的減少。而以蛋白質生合成抑制劑cycloheximide處理人類胚胎腎臟293T細胞後,46.5 kDa的蛋白質訊號會逐漸消失且35kDa蛋白質訊號會增加。由以上結果可知rpDNase II的轉譯後加工切除發生於溶酶體中,且轉譯後加工切除並不參與pDNase II活化過程。
pDNase II具有六個N-醣基化位置,分別是Asn72、Asn88、Asn171、Asn214、Asn268與Asn292,我們利用定位點突變的方式將此六個天門冬醯胺 (asparagine)殘基分別突變成麩醯胺酸 (glutamine),再將構築完成的突變株以暫時轉染方式送入人類胚胎腎臟293T細胞表現突變重組蛋白質,此六個突變蛋白質的酵素活性並不因點突變而有大幅減少,另外,經b-N-Acetylglucosaminidase H去除所攜帶醣基的rpDNase II,仍可在活性染色膠體上顯示活性。 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/41248 |
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顯示於系所單位: | 生物化學暨分子生物學科研究所 |
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