介白質－6與第二型環氧酵素增益胃癌之血管內皮生長因子及腫瘤血管新生

Abstract

血管新生（angiogenesis）是許多實體腫瘤甚至血液科腫瘤發生、生長、侵犯、及轉移所不可或缺的致病機轉。近年來，慢性發炎與其相關的因子在癌症致病機轉中所扮演的角色逐漸被了解，然而發炎反應相關因子在腫瘤血管新生中的作用目前所知仍屬有限。本研究有兩部分，分別探討與發炎有關的介白質－6（interleukin-6, IL-6）及第二型環氧酵素（cyclooxygenase-2, COX-2）在胃癌中與血管新生及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的相關性及作用機制。 第一部分、介白質-6在胃癌腫瘤血管新生的角色 介白質－6是一個發炎前驅性細胞激素（pro-inflammatory cytokine）。過去研究報告顯示，介白質－6與幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori, H. pylori）相關的胃炎及胃癌（gastric carcinoma, GC）疾病病程有關，但其對於胃癌之致癌機轉仍未完全了解。血管內皮生長因子則是一個過去研究已知的胃癌重要血管新生因子。本研究目的在釐清介白質-6是否可以調節胃癌血管內皮生長因子及血管新生機制。 臨床研究部分蒐集54個取自臺大醫院胃癌手術切除標本，進行介白質－6、血管內皮生長因子、及腫瘤血管的組織免疫染色檢查。結果顯示介白質－6免疫活性與血管內皮生長因子免疫活性及腫瘤細微血管密度（microvessel density, MVD）有顯著正相關。基礎研究部分，本研究先篩檢四株胃癌細胞株對介白質－6刺激的反應，以酵素連結免疫吸收測定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）測定其血管內皮生長因子表現量，發現其中兩株細胞株可以隨介白質－6刺激的劑量及時間增加而增加血管內皮生長因子分泌量。接下來，本研究利用火蠅發光酵素報導基因分析法（luciferase reporter gene assay）探討介白質－6的三種細胞訊息傳遞路徑中，何者與血管內皮生長因子的調控有關。結果顯示JAK/STAT路徑（JAK/STAT pathway）可以媒介介白質－6刺激血管內皮生長因子的效應。 確認介白質－6可以經由特定訊息傳遞路徑刺激胃癌細胞株產生血管內皮生長因子後，本研究利用人類臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）進一步探討介白質－6是否可以有效增加體外血管新生（angiogenesis in vitro）。結果顯示介白質－6的確可以增進人類臍靜脈內皮細胞的生長及管狀網絡形成。另外，以Matrigel栓子試驗（Matrigel plug assay）進行小鼠的體內血管新生（angiogenesis in vivo）分析，亦顯示介白質－6也可以增進體內血管新生。上述的介白質－6體外及體內血管新生效應，經由中和性抗血管內皮生長因子抗體拮抗血管內皮生長因子後，均可以有效抑制介白質－6引起的血管新生效應。此結果顯示介白質－6對血管新生增進的效應，主要來自於其誘導之血管內皮生長因子分泌的作用。 第二部分、第二型環氧酵素在胃癌腫瘤血管新生的角色 第二型環氧酵素（cyclooxygenase-2, COX-2）是在發炎中一個可被誘導的酵素，同時也被發現在多種惡性腫瘤中過量表現。過去研究發現，第二型環氧酵素能促進癌症腫瘤逃脫細胞凋亡（apoptosis）機制、抑制宿主免疫攻擊、和增益癌細胞侵襲力。但第二型環氧酵素與腫瘤血管新生的研究仍屬有限。 本研究臨床部分探討第二型環氧酵素與胃癌血管新生的相關性是否存在。54個取自臺大醫院胃癌手術切除標本的組織免疫染色，顯示了胃癌的第二型環氧酵素、血管內皮生長因子、和腫瘤血管密度的顯著正相關性。同時，也發現此種正相關性主要存在於Lauren氏瀰漫型胃癌、非賁門胃癌、以及幽門螺旋桿菌感染陽性胃癌。此結果一方面證實了第二型環氧酵素在胃癌血管新生扮演角色，另一方面也指出了特定胃癌亞型有此相關性。 基礎研究部分，目的建立解釋上述臨床現象的實驗模式並探索其機制。在轉殖表現第二型環氧酵素的載體後，胃癌細胞株AGS可以增加第二型環氧酵素及前列腺素E2（PGE2）表現，並增益了人類臍靜脈血管內皮細胞的增殖和管狀網絡形成。第二型環氧酵素在人類臍靜脈內皮細胞的體外生成血管效應，可經由阻斷血管內皮生長因子而被抑制，也可被第二型環氧酵素抑制劑NS-398抑制。為了闡明第二型環氧酵素增加血管新生的機制，我們建立了一個穩定表現第二型環氧酵素的胃癌細胞株AGS/COX-2和它的載體控制組細胞株AGS/pcDNA3（不表達第二型環氧酵素），轉殖效果經測定第二型環氧酵素及前列腺素E2表現量加以確認。在 6個血管新生相關的因子中，血管內皮生長因子在 AGS/COX-2顯著地表現。本研究接著轉殖反義（anti-sense）缺氧可誘導因子－1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）以減少細胞的缺氧可誘導因子－1α蛋白，此使血管內皮生長因子在AGS/COX-2的生成顯著減少。我們發現原型AGS細胞以前列腺素E2刺激後，缺氧可誘導因子－1α及血管內皮生長因子同時增加，但此效應可以被前列腺素E2 EP1受體拮抗劑 SC19220阻抑。此外，用NS-398先處理以減少前列腺素E2生合成後，可以抑制缺氧可誘導因子－1α的累積，同時也如同轉殖反義缺氧可誘導因子－1α般地抑制了血管內皮生長因子的製造。這部分研究成果支持「第二型環氧酵素/前列腺素E2/缺氧可誘導因子－1α/血管內皮生長因子路徑」為胃癌的腫瘤血管新生的機制之一。 結論 本研究呈現了臨床上介白質－6及第二型環氧酵素與胃癌血管新生相關的證據，並分別指出該相關存在於那些胃癌亞型。同時基礎實驗也分別闡明了關於介白質－6及第二型環氧酵素在胃癌血管新生中作用的機制。簡言之，即介白質－6循「JAK/STAT路徑」增加血管內皮生長因子生合成來增益胃癌血管新生；第二型環氧酵素循「前列腺素E2/缺氧可誘導因子－1α路徑」增加血管內皮生長因子生合成來增益胃癌血管新生。這些成果增進了慢性發炎及其相關因子對於胃癌血管新生及相關因子的了解，亦提供了未來以抗血管新生療法治療胃癌的可能方向及理論基礎。