Ralstonia solanacearum GMI1000 N-醯化高絲胺酸內酯醯化酶之表現及其酵素特性分析

Abstract

本研究利用PCR的方式，次選殖Ralstonia solanacearum GMI1000中的aac基因，利用四種不同的表現載體來建構Aac蛋白的表現菌株，純化此酵素並分析其酵素特性。經由胺基酸序列比對分析，發現Aac與Ralstonia sp. XJ12B的AHL acylase以及Ralstonia metallidurans CH34的penicillin amidase分別有89 %與88 %的相似性，屬於N-terminal nucleophillic (Ntn) family。由軟體預測Aac蛋白為一分子量大小85 kD，pI 8.0，且N端帶有signal peptide的蛋白質。利用四種表現載體，並選擇三種不同的大腸桿菌作為表現菌株，其中以pET43.1a(+) Factor Xa-GMI1000aac重組質體，在表現菌株Rosetta (DE3)2中誘導表現蛋白質，於30 ℃下能夠獲得較多量的可溶性Aac蛋白。而其他兩種重組質體体pET32a(+) Factor Xa-GMI1000aac與pET41a- GMI1000aac，在25 ℃下亦能得到可溶性的Aac蛋白。比較此三種表現系統所誘導表現蛋白質之比活性，其中以pET43.1a(+) Factor Xa-GMI1000 aac系統表現的蛋白質有最高的活性，以C8HSL為基質活性可達59 U/μg。重組Aac蛋白質經純化並去除序列上之融合蛋白後，其最適反應溫度為30 ℃，最適酸鹼值為7.5，在4℃下保存的酵素穩定度，保存至第五天時，活性僅為原來的55 ％。Aac對於中長鏈的AHL (C7HSL、C8HSL、C10HSL、C12HSL)具有活性，其中對於C8HSL有最高的比活性，而對於短鏈以及含有氧取代基的AHL (C4HSL、C6HSL、3OC6HSL)則不具分解能力，但對於3OC8HSL則有些微的活性 (2.73 U/μg)。以質譜儀 (Q-Tof Ultima)分析經Aac作用的AHL水解產物，證實產物中有HSL的存在，Aac在AHL分解酵素中屬於AHL acylase可得到直接的証明。