探討SIRT6 於hEGFRT790M CL1-0 Gefitinib 抗藥性細胞株所誘導之EMT 抑制角色

Abstract

文獻指出肺癌為2011年癌症死因之首，而其中以非微小細胞肺癌(Non small cell lung cancer，簡稱NSCLC)比例為大多數，約有8成之多。研究發現，NSCLC之成因與過度活化之EGFR pathway有極高之關聯性，其中以EGFR tyrosine kinase domain之變異(以L858R為主)為主要因素，因此目前臨床上用治療NSCLC之small molecules主要為tyrosine kinase inhibtors (簡稱TKIs)如Gefitinib、Erlotinib等為主要用藥，但研究卻發現，經上述藥物治療後，患者出現第2種適應型tyrosine kinase domain mutant T790M，而此種變異能大幅降低TKIs之治療效果，產生具抗藥性之癌細胞，因此要如何對抗此種變異所帶來之抗藥性問題，為目前最為棘手之議題。研究指出，過度活化之EGFR pathway能促進cancer metastasis來造成NSCLC患者之死亡，而主要因素為誘導Epithelial–Mesenchymal Transition(簡稱EMT )過程之進行，也因此若能抑止EMT之進行，或許就能克服TKIs之抗藥性問題來治療NSCLS患者。Sirtuin 6 (簡稱SIRT6) 為Sirtuin protein family之一員。先前文獻指出，SIRT6能將histone 3 acetylated-lysine 9進行去乙醯基化，進而干擾NF-kB之作用；且有文獻指出，SIRT6在肝癌發展過程中有重要之角色，其能誘導不正常之肝細胞死亡，顯示其或許具有抗癌之功能。因此在本次實驗中將探討SIRT6在hEGFR790M mutant cancer cell之功能為何。 在一開始先建立出能感應EMT進行之Thrombomodulin promoter eGFP vector ( TMp EGFP vector ) CL1-0 cell line，接著將 pBABE puro wt-hEGFR vector、pBABE puro hEGFR T790M vector分別轉殖入上述之cell line，後以抗生素puromycin篩選後，得到TMp eGFP / wt-hEGFR、TMp eGFP / hEGFRT790M CL1-0 cell line。以EGF (50ng/ml)處理24小時後發現，TMp eGFP/wt-hEGFR CL1-0之eGFP signal有增強之情況；而TMp eGFP/hEGFRT790M CL1-0則無論有無處理EGF，都有明顯之eGFP signal，此結果表示eGFP signal之強弱能代表EGFR pathway活化程度，而eGFP signal也與EMT marker SNAIL之入核比例有正相關性。將SIRT6-pDsred expression C1 vector轉殖入上述cell line後發現，若有表現出SIRT6-Dsred fusion protein則eGFP signal有弱化甚至消失之結果；另以Western blotting檢測後也發現SIRT6 protein之含量在CL1-0相對較高，而CL1-5相對偏少，顯示SIRT6與cancer invasive progression確實有關聯性；而MMP7 (為促進EMT進行之重要因子) 在TMp EGFP/hEGFRT790M CL1-0、CL1-5中gene expression也確實較高。以Dual luciferase assay檢測後發現，若表現出SIRT6-Dsred fusion protein，則能降低MMP7 luciferase signal，最後將此重組之vector送入CL1-5後也發現到MMP7之gene expression有下降之趨勢，綜合藉由上述結果，認為SIRT6能降低MMP7之gene expression來抑止EMT之進行。