比較胚胎培養液細胞游離DNA、滋養層採樣以及內細胞團採樣之染色體篩檢成效

Abstract

"對於習慣性流產、3次以上試管嬰兒療程失敗、高齡婦女、家族有染色體異常病史的夫妻接受試管嬰兒治療時，需要施行胚胎著床前染色體篩檢(preimplantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A)，目的是在植入前先了解胚胎染色體是否正常。常規的PGT-A必須採樣囊胚滋養層細胞(TE)作檢驗，這種侵入性的篩檢需要純熟技巧，若胚胎發育不良，則無法進行細胞採樣，採樣過程也可能會對胚胎造成損害，而細胞採樣可能會出現偽陰性和偽陽性，故目前對於PGT-A的應用仍有很多疑慮。 近幾年，有學者在培養人類囊胚培養液中發現細胞游離DNA(cfDNA) ，嘗試用剩餘的囊胚培養液(SCM)做胚胎染色體分析，來比較侵入性與非侵入性的PGT-A中各種參數的一致性。目前的瓶頸為無法確認胚胎的cfDNA是否完整，cfDNA與TE採樣和整個胚胎的各種參數一致性如何，也無法確認cfDNA來自於胚胎本身或胚胎廢棄細胞所排出，或是剔除卵丘細胞過程所遺留下來的DNA(母源汙染)等。2016年開始，有學者以單一SCM分析胚胎的cfDNA，研究結果所得到倍性的一致性偏低，近幾年有些學者將剩餘的培養液SCM與囊胚腔液(BF)作為共同培養液樣本分析胚胎的cfDNA，目前世界上所得到倍性的一致性結果差異性大。 本研究的捐贈冷凍囊胚組樣本為剩餘培養液(SCM)結合囊胚腔液(BF)、內細胞團(ICM)採樣與滋養層(TE)採樣樣本，新鮮培養囊胚組樣本為剩餘培養液(SCM)結合囊胚腔液(BF)與滋養層(TE)採樣樣本，利用NGS進行序列分析，來了解這兩個組別胚胎染色體經序列分析後的一致性，並探討niPGT-A是否將來可以應用在臨床上。在捐贈囊胚組，共收集了55個冷凍囊胚，其中2顆WGA沒有訊號，3顆有雜訊故排除分析，最後分析50個，包括12個整倍體、28個非整倍體及10個鑲嵌型胚胎，這些囊胚先前已經過TE採樣之PGT-A檢測；捐贈的囊胚解凍後，個別以20-μLLifeGlobal培養微滴覆蓋培養油，並於timelapse培養箱獨立培養(37 °C ,5% O2, 6% CO2 )，經培養24小時，收集囊胚腔液(6-μL)，接著以雷射輔助孵化設備(Zilos Tk laser ,Hamilton Thorne Biosciences)將囊胚打洞，並於一小時後收集囊胚腔液與培養液(6-μL)。另外再進行囊胚內細胞團(ICM)之採樣。在新鮮囊胚組，分析35個囊胚，其中10顆WGA沒有訊號，每顆胚胎個別以20-μL LifeGlobal培養微滴覆蓋培養油後於timelapse培養箱獨立培養，培養後第四天進行置換新鮮培養微滴，培養到第五天(24小時)評估囊胚等級，收集完全膨脹囊胚之培養液(6-μL)，接著以雷射輔助孵化設備將囊胚打洞，進行雷射囊胚塌陷後，使囊胚液流出與剩餘的培養液混合，一小時後收集此混合的培養液(6-μL)。另外再進行囊胚滋養層(TE)之採樣。對照組為未接觸囊胚的培養微滴。 所有樣本放置於PCR tube內，冷凍於-20℃直到分析。WGA PGS kit為PerkinElmer PG-Seq Rapide niPGT kit，Sequencing and Data Analysis為Illumina MiSeq v3 Reagent,PG-Find分析軟體。 由結果可看出與單獨收集SCM相比，混合培養液的WGA放大率比較高，捐贈組訊號率明顯高於新鮮組具顯著差異(96% VS 71%，P=0.0002)。捐贈組囊胚ICM vs SB倍性一致性為88%(44/50)，ICM vs TE倍性一致性82%(41/50)，沒有顯著差異(P=0.277)。 ICM vs SB 的FPR為4.8%(1/21) ， ICM vs TE的FPR為42.9%(9/21)，有差異顯著(P=0.0015)。ICM vs SB 的PPV為96%(24/25)， ICM vs TE的PPV為76.3%(29/38)，有顯著差異(P=0.0437)。ICM vs SB 的Specificity為95.2%(20/21)，ICM vs TE的Specificity為57.1%(12/21)，具顯差異著(P=0.0017)。新鮮組25個囊胚的TE vs SB倍性一致性為44%(11/25)； 性別一致性為84% (21/25)：有三個疑似母源DNA汙染，一個是雜訊過多，無法代表真實結果。新鮮組有九個胚胎經iPGT-A篩檢為整倍體的胚胎植入，其中七個胚胎著床，一個已生下正常胎兒，六個持續懷孕，周數大部分皆於第二孕期，另外兩個沒有著床。 目前niPGT-A的疑慮為培養液有多種可能的汙染源，主要可能有母源(卵丘細胞)汙染、或其他外來汙染源等，因此在受精之前必須仔細地去除卵丘細胞，更換培養液時也要嚴謹洗滌胚胎，更要避免外來汙染源。雖然niPGT-A的診斷看起來有參考價值，目前仍無法取代TE，輔助參考可以應用於：1.拯救iPGT-A誤診的胚胎，2.不合適做iPGT-A的囊胚。但目前需要更多證據來證實這項診斷技術在臨床的可行性。"