利用soat2剔除之斑馬魚探討膽固醇持恆作用於胚發育時期之基因調控

Abstract

膽固醇為生物必需之營養分子，其持恆作用與眾多病理現象有關，生物體內膽固醇過多或過少皆有致病的風險，由此可見膽固醇持恆作用相當重要。血液中的膽固醇主要有兩種來源，一種為攝食後由小腸吸收進入，另一種為肝臟的膽固醇新生作用，膽固醇進入血液後，因其帶有具極性之羫基，使膽固醇在循環系統中輕易的以擴散作用移動於不同細胞間，而經酯化作用去除羫基的膽固醇酯能更穩定的透過特定脂蛋白攜帶至目標組織，確保其運輸效率，因此酯化作用在膽固醇持恆中扮演十分重要的角色。目前已知三個酵素可以在脊椎動物體內進行膽固醇酯化作用，分別為LCAT、SOAT1、SOAT2，其中尤以SOAT2和小腸吸收與肝臟合成之膽固醇輸出最為相關。 在斑馬魚胚發育時期，從卵黃吸收膽固醇之路徑和人類小腸上皮細胞吸收膽固醇十分相似，本研究室先前發現soat2基因變異斑馬魚並無明顯缺陷，且特定基因出現補償現象，顯示卵黃吸收被阻礙時，斑馬魚透過基因網路調控膽固醇酯化，維持體內膽固醇持恆。因此本實驗進一步以soat2剔除之斑馬魚胚為模型，探討soat2缺失對斑馬魚之影響，並建立更完整的膽固醇持恆作用基因調控網路。實驗分為三部分，第一部分為soat2剔除斑馬魚之篩選，使用研究室先前產製之soat2基因變異斑馬魚株進行配種，透過DNA定序篩選子代中soat2剔除之斑馬魚，並進行後續實驗。第二部分則是觀察soat2剔除、soat2調降與野生型斑馬魚胚之卵黃吸收、酯化情況，時間點為受精後0、24、48、72及96小時，以卵黃大小的變化作為卵黃吸收之指標，結果顯示，soat2剔除及抑制的斑馬魚胚卵黃在不同時間點均顯著大於野生型斑馬魚，而soat2剔除組別之卵黃在48至96小時開始以較接近野生型斑馬魚的速度縮小，暗示這段時間可能因soat2的缺失引起卵黃吸收補償現象，另外，測量斑馬魚胚在上述時間點的總膽固醇、游離膽固醇以及膽固醇酯含量，比較不同組別膽固醇酯化情形，結果顯示，soat2 剔除組別之總膽固醇含量顯著低於WT組別，而游離膽固醇及膽固醇酯在各組間無顯著差異，證實膽固醇酯化作用可能也出現補償現象。第三部分為膽固醇基因調控網路之建立，本研究針對24、72及96小時之斑馬魚胚進行轉錄體分析，找出soat2剔除與野生型斑馬魚之表現差異基因，並利用多種生物資訊分析工具建立膽固醇持恆作用基因調控網路，透過轉錄體分析結果發現soat2缺失引起膽固醇酯化、運輸、合成及持恆作用相關的基因表現量與WT出現明顯差異，並且在胚發育時期的體軸生長訊號如Hedgehog、TGF-beta及Wnt信號路徑相關基因也產生明顯不同，證實soat2基因剔除斑馬魚胚確實在維持正常生理機能的關鍵時刻，出現相關的基因調控網路變化。 綜言之，本實驗之結果證實soat2缺失引起生物體內之膽固醇酯化、吸收的代償現象，未來將進一步探討補償soat2缺陷的重要樞紐，建立更清晰的膽固醇持恆作用基因調控網路，期望為膽固醇相關疾病之治療提供線索。