設計標記流感之核蛋白三聚體的雙功能二疊氮光親和探針

Abstract

甲型流感病毒經常引起季節性的呼吸道疾病，甚至導致嚴重的全球性大流行。由於核蛋白（NP）在流感病毒生命週期中扮演重要的角色，又因其基因序列不易變異的特點，使核蛋白成為抗流感藥物的目標蛋白之一。流感病毒核蛋白通常以三聚體（trimer）的形態存在，核蛋白單體（monomer）構成三聚體時，其尾端套環（tail-loop，胺基酸402到428）將插入至另一個核蛋白單體的主體結構域（body domain）之尾端套環結合區（tail loop binding pocket）中。已知E339...R416鹽橋的相互作用對於核蛋白三聚體的形成至關重要。先前已發現化合物A對流感病毒具有良好的抑制活性，其通過破壞核蛋白單體間E339...R416鹽橋作用力，進而抑制流感病毒的複製。 基於先導化合物A的結構，我們的團隊設計出一個同時具有疊氮芳香基（aryl azide）和疊氮烷基（alkyl azide)的雙功能化合物JMF4496，致力於進行結構與活性關係（structure−activity relationship，SAR）的研究。該雙功能化合物對流感病毒（H1N1）也具有良好的抑制活性（EC50 = 9.06 μM）。 疊氮基團可以透過UV光照射而產生高反應性的氮烯活性中間體，並與鄰近的胺基酸殘基生成共價鍵結。鑑於此雙功能光親和探針之疊氮芳香基在304奈米處表現出最大吸收，其波長長於疊氮烷基的吸收波峰（259奈米）。此雙功能化合物上的疊氮芳香基被選擇性照光活化，使其嵌入核蛋白的活性位點附近之殘基；而另一端的疊氮烷基則與帶有末端炔烴的生物素標籤分子進行銅（I）催化炔−疊氮化物環加成（CuAAC）反應，並在胰蛋白酶（trypsin）的消化反應（digestion）後，進行胜肽鏈富集、純化與隨後的質譜分析。 透過交叉比對奈流液相層析串聯質譜（nano LC-MS/MS）在 Mascot 分析中的結果，我們識別出五個候選的目標胜肽片段。分子嵌合（molecular docking）實驗表明光親和探針JMF4496可與目標片段之一的401ASSGQISIQPTFSVQR416結合，干擾尾端套環插入另一個核蛋白單體的主體結構域，從而破壞核蛋白的三聚化。本研究結合化學合成、光化學、生物化學和質譜方法來驗證尾端套環上的目標胜肽以及R416胺基酸殘基在核蛋白三聚體中的作用。