應用質譜儀進行第五型核酸內切酶與第一型DNA聚合酶修復亞黃嘌呤之研究

Abstract

在一般生理環境下，DNA的腺嘌呤 (adenine; A)會自發性水解脫胺(deamination)產生脫氧肌苷 (deoxyinosine ; dI)。Deoxyinosine如果未修復，在DNA複製時，因為dI偏好與dCTP結合，會造成A:T變G:C的transition mutations。當DNA暴露由輻射、UV、亞硝酸鹽、熱等引起的ROS環境時，會促進adenine的deamination。在Escherichia coli (E. coli)中，dI的修復反應由endonuclease V (Endo V; nfi gene product) nicking作為起始。先前本實驗室進行 in vitro minimum component reconstitution assay時，發現Endo V、DNA polymerase I (Pol I)和E. coli DNA ligase共同反應後成功修復dI，而且發現Pol I的3’-5’ exonuclease對於修復十分重要。先前研究發現Endo V在辨識dI後，會在dI 3’端第二個phosphodiester bond產生一個nick，之後Endo V會結合在DNA上，不會turnover。然而，先前本實驗室進行 in vitro assay時，加入有proofreading能力的Pol I或Klenow fragment (KF)的情況下，Endo V與Pol I turnover增加至少4倍。這結果顯示Endo V與Pol I在修復反應過程中可能有交互作用。 為了證明Endo V和Pol I之間在修復dI時可能有交互作用，我們使用MALDI-TOF MS進行分析，當Endo V修復有dI的DNA時會產生nicking product，並且有分子量上的改變，藉由分子量的差異可以辨識出nicking product。使用dI ssDNA substrate、I-T dsDNA substrate和dI與不同正常鹼基配對的DNA substrate分析Endo V nicking活性，發現針對不同substrate具有不同的修復效率。其中，Endo V對含dI ssDNA有較高的活性。 使用40 bp I-T substrate進行實驗時，發現Endo V在反應一段時間後幾乎沒有turnover，之後追加等量的Endo V進行反應，發現增加等比例的nicking products。而當在反應中加入KF時，Endo V total product有明顯增加，顯示KF可能是藉由proofreading exonuclease活性移除dI來促進Endo V turnover。為了驗證這個假設，我們使用proofreading exonuclease deficiency KF (KF exo-)和24 bp I-T substrate進行實驗。我們意外發現KF exo-也可以促進Endo V turnover。之後我們使用40 bp I-T和I-C substrate並在反應中加入KF或KF exo-進行實驗，我們推論Endo V和KF之間的interaction是透過Endo V nicking後使dI露出，讓KF辨識後進行修復，並且值得進一步深入研究。為了進一步研究in vitro和in vivo中，Pol I和Endo V在修復過程中的交互作用，我們設計帶有CC marker 的I-T異雙股質體進行實驗。我們已經構築出有selected marker的質體來進行substrate preparation。