東亞百香果病毒單株抗體與分子檢測方法之研發及應用

Abstract

"百香果種苗繁殖及銷售是整個百香果產業的重要經濟利基，臺灣本土每年種苗需求量約為90萬株，其餘種苗多外銷往東南亞，年出口量達800萬株。為了防止病害隨著種苗外銷而蔓延，無病毒健康種苗的生產及病毒檢測極為關鍵。病毒危害對百香果的栽培影響巨大，其中又以東亞百香果病毒 (east asian passiflora virus, EAPV) 造成的百香果木質化病最為嚴重，受感染的植株會有生長勢低落、葉片嵌紋、果實木質化、畸型化、果腔縮小、果汁風味變差⋯⋯等病徵。相較於RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)，利用免疫學原理之酵素連結免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 為一成本較低、效率較高的病毒檢測方法。因此，本研究針對EAPV製備高敏感度及高專一性之單株抗體，以應用於病毒免疫檢測。將EAPV之鞘蛋白基因選殖至表現載體pET-28a(+)，並以大腸桿菌系統 (Escherichia coli BL21 (DE3)) 表現重組鞘蛋白作為免疫抗原，注射小鼠產生免疫反應，經細胞融合技術，篩選獲得一單元抗體細胞株mAb7H8G9。經間接酵素連結免疫吸附法 (indirect-ELISA) 分析，純化後之抗體對EAPV病葉粗萃取液的力價可達16384倍，並且能夠檢測到稀釋640倍的病葉粗萃取液。藉由田間百香果病毒調查，檢視所設計之ELISA檢測方法的效力，顯示mAb7H8G9對臺灣主要栽培品種台農一號的檢測正確率高。另外，也針對EAPV之AO strain與IB strain都具有的保守區域以及歧異度較大的區域，分別設計出EAPV廣效性引子對，以及兩strain各自的專一性引子對，並首次建立EAPV RT-qPCR (real-time RT-PCR)。本研究研發不同面向的檢測方法，可提供未來學術研究與百香果防檢疫之應用。"