探討轉譯抑制對miRNA396a/b介導 SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)調控機制之影響

Abstract

Phyllody symptoms1 (PHYL1) 是花生簇葉菌質體中主要造成花器葉化的效應子。在先前研究顯示，PHYL1 效應子能夠抑制 microRNA396 (miR396) 的表現，因 miR396 的表現量減少，進而使其目標基因 SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) 調控不當。SVP 為負調控開花之重要調節基因，因為 SVP 受到miR396 表現量下降的影響，無法受到妥善的調控，造成 SVP 表現過量，導致葉狀花之形成。但 PHYL1 是如何調控 MIR396 基因表現？PHYL1 效應子如何與寄主因子之相互作用導致之病徵發展？這些機制尚不明確。其中，SVP 受 miR396 調控的機制在降解組的定序資料中顯示，miR396 並非經由 mRNA 剪切方式來調控 SVP。是否是經由轉譯抑制或其他方式來調控 SVP的表現，並無文獻報導。在阿拉伯芥中，miR396 具有兩種同功型 (miR396a及miR396b)，目前兩種同功型調控 SVP 的貢獻度尚不明確，也沒有證據直接證明 miR396 會影響 SVP 之蛋白表現。PHYL1、SVP 和 miR396 之間的關係仍然有很多尚未解惑的問題，因此，我們利用 CRISPR/Cas9 系統在阿拉伯芥中建構了 miR396a 及 miR396b 之單突變株及雙突變株。本研究也生產出 SVP Keratin-like domain (SVP_K) 之特異性抗體，以確認在不同突變株中之 SVP 蛋白表現量。目前我們已經獲得 miR396 純合子之單突變株及雙突變株，且 α-SVP 特異性抗體可以測得 SVP 蛋白。後續研究中，我們也在菸草中暫時性表現野生型及突變之 SVP，並以 real-time RT-PCR 及西方墨點法比較有無外加 miR396 處理之 SVP 表現量。結果顯示，突變型的 SVP mRNA 加入 miR396 後，有較低的 SVP 蛋白表現，但其 RNA 表現量卻無明顯下降。顯示，miR396 對於調控 SVP 之蛋白是具有影響力並與先前推測藉由轉譯抑制調控有相符之處。期望本研究可以幫助未來對於 miR396、SVP 及 PHYL1 之關係能有更深入之了解。