利用Semaphorin6A基因剔除小鼠模型探討Semaphorin6A為基礎之重組蛋白於肺癌免疫治療的效果

Abstract

全球肺癌於癌症排名中致死率高居第一、發生率位居第二，五年存活率僅21％。肺癌患者通常接受手術、化學療法、放射療法或標靶療法，而近期較新的免疫療法正蓬勃發展，免疫療法可以藉由刺激抗癌免疫反應或抵消由癌細胞誘導的免疫抑制機制達成治療功效。先前研究證實Semaphorin6A（Sema6A）可以透過競爭Semaphorin3A (Sema3A)與Neuropinlin1（Nrp1）/ Plexin-A4共受體的結合而增強細胞毒殺型T細胞的增生能力同時減少調節型T細胞的增生能力，Sema6A成為免疫治療的潛在目標。由於Sema6A的分子量高、結構複雜且為穿膜蛋白，製程困難，因此，本研究設計兩種Sema6A為基礎的重組蛋白—SEMA-PSI與SEMA，並使用Sema6A基因剔除C57BL/6J小鼠探討Sema6A蛋白、SEMA-PSI重組蛋白及SEMA重組蛋白對於抗癌免疫反應的影響。競爭試驗顯示Sema6A蛋白、SEMA-PSI和SEMA重組蛋白於濃度為5至20 μg/ml時可競爭Sema3A與Nrp1的結合。透過共培養LL/2小鼠肺癌細胞株與來自皮下注射LL/2的Sema6A基因剔除以及野生型小鼠的脾臟細胞，顯示SEMA重組蛋白均可顯著減少調節型T細胞的增生能力，也代表抗癌免疫的提升，SEMA-PSI重組蛋白可降低調節型T細胞的增生能力但未達顯著，而Sema6A蛋白未顯著影響免疫細胞的增生能力。活體實驗顯示，LL/2腫瘤於Sema6A基因剔除小鼠的生長較野生型小鼠快速，且腫瘤浸潤毒殺型T細胞的比例也顯著低於野生型小鼠。為了評估在活體中Sema6A、SEMA-PSI和SEMA重組蛋白治療後的抗癌免疫情形，皮下注射LL/2細胞至Sema6A基因剔除小鼠，每兩天腫瘤周邊皮下注射20μg的蛋白，與對照組相比，SEMA重組蛋白可顯著降低腫瘤的生長，而Sema6A和SEMA-PSI重組蛋白未顯著降低腫瘤的生長，SEMA重組蛋白治療的組別中，腫瘤浸潤毒殺型T細胞無顯著差異，而腫瘤浸潤調節型T細胞有下降趨勢但未達顯著，取其脾臟細胞發現毒殺型T細胞及自然殺手細胞的增生能力有上升趨勢但未達顯著，調節型T細胞的增生能力也有下降但未達顯著。另外於野生型小鼠模型中，SEMA-PSI及SEMA重組蛋白治療後未顯著降低LL/2腫瘤生長，但SEMA重組蛋白治療後的腫瘤浸潤毒殺型T細胞有上升趨勢，且調節型T細胞增生能力也有下降趨勢。為建立化學物質誘導的肺癌致癌模型，本研究將致癌物4-（甲基亞硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮 （NNK）腹腔注射至14隻Sema6A基因剔除及8隻野生型小鼠，觀察第16周及32周時鼠肺中結節的形成，僅一隻Sema6A基因剔除小鼠肺部外觀於第16周出現明顯腫瘤結節，依據病理組織型態判讀為骨肉瘤，而野生型小鼠肺部外觀皆未觀察到明顯腫瘤結節，經蘇木精-伊紅染色後，無論第16周或32周，小鼠肺部損傷程度於Sema6A基因剔除小鼠皆高於野生型小鼠，且未觀察到肺腺癌細胞或鱗狀上皮癌細胞的形成。 總結而論，LL/2腫瘤於Sema6A基因剔除小鼠中生長較野生型小鼠快速，且腫瘤浸潤毒殺型T細胞顯著降低。Sema6A蛋白、SEMA-PSI重組蛋白和SEMA重組蛋白可以競爭Sema3A與Nrp1的結合。活體外共培養結果顯示SEMA重組蛋白可顯著減少調節型T細胞的增生能力，意謂抗癌免疫反應的提升。活體試驗指出SEMA重組蛋白有提升抗癌免疫的趨勢，顯著降低LL/2腫瘤於Sema6A基因剔除小鼠的生長，綜上所述，SEMA重組蛋白的抗癌效果較Sema6A蛋白及SEMA-PSI重組蛋白優異，成為潛在的肺癌免疫治療蛋白。