建構可經環化重組酶活化之PE2報導基因小鼠及優化可用於Trp53 c.515G>A (p.R172H)基因編修之pegRNA設計

Abstract

CRISPR/Cas9系統是目前熱門的基因編修方式，這項技術於2020年贏得諾貝爾化學獎，且其不論是在各種模式動植物或臨床試驗中都被廣泛使用。而麻省理工大學David Liu 團隊改良CRISPR/Cas9系統，研發出'Prime editing (PE)'。這個新的基因編修版本，在符合一定設計條件下，能任意地進行核苷酸編修(序列置換、插入、刪除等)，不同於另一個編修版本”Base editor (BE)”，這個系統在設計上與使用上較具有彈性。與先前多種建立基因編修小鼠的方法比較，PE有潛力以更簡捷的步驟去精確地建立特定癌症小鼠模型，讓小鼠體細胞中這些特定點位突變更貼近臨床病人的基因突變狀況。因此，我在小鼠中的R26位點建立了PE2報導基因，未來希望能使用此R26R-PE2報導基因小鼠，與組織特異環化重組酶(tissue-specific cre)轉基因小鼠交配，以得到於特定組織啟動PE2編修系統的小鼠，來協助在體細胞中產生能精準模擬疾病基因突變組合的癌症模型。本論文聚焦於人類大腸直腸癌病患中的高頻突變等位基因TP53R175H所同源對應到小鼠之Trp53R172H (c.515G>A)突變，對此特定點位設計多種prime editor guideRNAs (pegRNAs)，來進行單個核苷酸G-to-A的基因編修。為進行pegRNAs之間的編修效率測試、比較，我於小鼠神經母細胞瘤細胞株與小鼠胚胎幹細胞中分別建立穩定表現PE2的系統，並透過桑格氏定序及次世代定序分析，嘗試去探討可能影響pegRNA編修效率之因素。未來希望能將效率較佳的pegRNA以腺相關病毒(AAV)載體送入小鼠特定體細胞內，以精確編修產生包含突變等位基因Trp53R172H的癌細胞，進而在不變動小鼠其他組織細胞之遺傳背景下，模擬病患疾病發生的狀況，以俾未來運用此系統去協助探討此特定突變等位基因在大腸癌症進程中所扮演的角色，抑或是藉此於活體內尋找或驗證目前尚未確立的多基因交互作用。