RYR1疑似惡性高熱症致病變異點之功能性研究

Abstract

"惡性高熱症（Malignant Hyperthermia）是一種在臨床上與科學上都具有重要性的特徵性疾病，目前已知有兩個特定基因（RYR1跟CACNA1S）與至少四個基因座會導致惡性高熱症，佔總體病例中50-70%。RYR1基因則是目前所知會引起惡性高熱症最重要的基因。次世代定序（Next-generation sequencing）正徹底改變遺傳學，而我們團隊已經建立了一個以次世代定序為基礎的惡性高熱症基因檢測平台，此平台過去也幫助我們找到許多過去從未發表過的變異點，然而這些變異點的致病性依舊無法確認。 現行變異點的致病性的指南相當嚴格，在過去被報導過約300個RYR1的變異點中，只有48個被證明具有致病性，這是相當大的問題，每當我們為惡性高熱症的病人進行基因檢測後，若發現的變異點不在48個已確認的致病變異點中，我們將無法發表臨床相關報告，因此，我們迫切需要一個可靠的、經濟高效的體外RYR1功能性或致病性的測定。 先前的功能性測試是利用兔的RYR1 cDNA，而不是人類的RYR1 cDNA，且後續的細胞實驗也並非在人類的骨骼肌細胞，而是在HEK293或是從小鼠取下的肌管，然而這在科學上並不是非常令人滿意。因此，我們想要開發一種從人類RYR1 cDNA開始，並導入我們有興趣的變異點，而後於培養的人類骨骼肌細胞內進行功能性研究。 我們以Gibson assembly的方式製造含有RYR1 cDNA-IRES-H2B-mCherry-PiggyBac的表現質體。我們測試了RD與RC13這兩株人類骨骼肌細胞株的基因組DNA（genomic DNA, gDNA）以確定其RYR1與CACNA1S上沒有惡性高熱症之致病變異點。我們也針對肌肉細胞的特性對此二株細胞進行測試，我們以免疫細胞化學染色（immunocytochemical staining）來偵測肌凝蛋白與RYR1的表現，並以RT-PCR的方式偵測兩種細胞中與鈣離子相關基因的表現。我們將能表現mCherry且大小為20 kbp的質體用TransIT-X2轉染到RD與RC13。我們以流式細胞儀偵測mCherry的訊號，並將之視為轉染效率，以計算不同條件下的轉染效率。我們以咖啡因作為誘發劑來引發細胞質內鈣離子濃度變化，並用fluo-4進行偵測，以此來偵測RD與RC13細胞本身鈣離子釋放之表現。根據我們研究發現，RD與RC13這兩株細胞本身並不帶有惡性高熱症之致病變異點，且都有可接受的轉染效率，再給予咖啡因刺激後也都有觀測到相較於HEK293細胞更貼近於正常人體生理情況相近的表現，因此我們認為此系統將能更有效且準確的模擬惡性高熱症的病理機轉，我們將對於過去我們團隊發表過的台灣幾個常見的點位（c.6488G>T, c.1565A>G）以及其他幾個已被證實為致病變異點（c.487C>T, c.7042_7044del）與良性的點位（c.2677G>A）進行測試，與現有系統進行比較，此將對於惡性高熱症的研究有重要的貢獻。 "