開發GAA序列導入之基因治療對抗龐貝氏症

Abstract

龐貝氏症(Pompe disease)是屬於溶小體儲積症，為罕見單基因隱性遺傳疾病。GAA基因的變異會造成acid α-glucosidase缺乏，酵素的缺乏導致肝醣在溶小體內無法被分解成葡萄糖進而堆積，所以也被歸類在肝醣儲積症第二型(Glycogen storage disease type II)。肝醣的堆積會造成許多組織的功能受到影響包括肌肉、心臟甚至是中央神經系統，最後會導致患者因為呼吸衰竭而死亡。 目前對於龐貝氏症的治療，被FDA所許可的只有酵素替代性療法(Enzyme replacement therapy，ERT)。早期ERT的介入的確能提高患者的存活率及活動能力，但由於需終身注射及身體會引發免疫反應對抗注射的酵素，且無法解決根本的問題，所以目前仍有許多不同的治療方法同步在研究中，基因治療也是其中之一。導入完整的GAA序列讓細胞自己去持續的製造所缺乏的acid α-glucosidase進而分解肝醣改善症狀，這就是基因療法的策略。 本篇論文中我們應用CRISPR剪切的專一性及利用細胞同源重組修補的機制將human GAA基因放置於一個安全又穩定的表達區域Acta1 gene中，以達到讓該基因能穩定又安全的在特定區域進行表達，並產生所缺乏的GAA蛋白以利於未來基因療法之開發。此外，本篇論文中也利用在GAA的導入序列5’端與3’端加上sgRNA切點希望轉染時能同時被Cas9切割而呈直線狀態來提高同源重組的效力，期待能將更多的GAA基因置入到Acta1 gene中。我們首先利用軟體選出6組不同的guide RNA轉染老鼠C2C12細胞，再利用細胞分選儀收取帶有GFP的細胞，並用T7E1試驗來找出切割效力最好的sgRNA，利用Cas9使目標位置產生Double-strand break希望產生同源重組的修補機制將human GAA cDNA導入目標位置。 我們在qPCR的試驗中不但可以看到Human GAA的表現量而且在5’端與3’端加上sgRNA切點組別表現量較只有Human GAA的組別有顯著上升(p <0.001)。再透過西方墨點法的蛋白質電泳分析結果中，同樣的可以看到Human GAA 蛋白在5’端與3’端加上sgRNA切點的組別產生的GAA蛋白，較只有human GAA 的組別產生更多。 根據本實驗結果，我們找到能在Acta1 gene上切割效力最好的位點，可以在老鼠C2C12細胞中增加human GAA的表現量。希望能為未來的基因治療提供基礎的研究。