利用單分子螢光共振能量轉移影像技術觀察人類第二型拓樸異構酶α與DNA交互作用之動態變化

Abstract

DNA拓樸異構酶(DNA Topoisomerase，Top)是一種可藉由其切割-再接合活性解決DNA拓樸結構問題(DNA topological problem)的酵素。依據作用機轉的不同，拓樸異構酶可分為兩種類型:第一型拓樸異構酶(Type I topoisomerase)與第二型拓樸異構酶(Type II topoisomerase)。第一型拓樸異構酶不需仰賴三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)供給能量即可使DNA單股暫時斷裂，第二型拓樸異構酶則需要ATP參與供給能量才能使DNA雙股暫時斷裂。兩種類型的拓樸異構酶皆是藉由活性中心上的酪胺酸(tyrosine)打斷DNA的磷酸雙酯鍵(phosphodiester bond)，進而使DNA產生暫時性的斷裂。依據胺基酸序列及結構的相似性，兩種類型的拓樸異構酶又可更進一步的細分為A及B兩種亞型(subfamily)。本篇論文的研究主題為探討Type IIA中人類第二型拓樸異構酶α (human Topoisomerase II α，hTop2α)與雙股DNA相互作用間各個反應步驟的動態變化。 目前已可藉由單分子技術(single-molecule techniques)與螢光共振能量轉移技術(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)進行DNA-binding protein彎曲DNA結構的動態分析。本論文即是藉由兩項技術的結合，搭配物鏡型全內反射式螢光顯微鏡(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM)及高靈敏性的偵測系統，即時觀測hTop2α與雙股DNA相互作用間各個反應步驟的動態變化。 本論文的研究結果顯示本實驗室自行純化的hTop2α的確可彎曲雙股DNA。外加ATP後，high EFRET DNA彎曲群體的增加及雙股DNA處於彎曲構型時間的延長皆表明ATP的存在可能讓DNA更傾向於彎曲的構型。此外，使用relaxation assay測試藥物或化合物抑制hTop2α活性的結果中則發現化合物0785(濃度約200 nM時幾乎可完全抑制hTop2α活性)較目前臨床常用的hTop2α抑制劑-dexrazoxane (ICRF–187)(濃度達600 nM時亦未完全抑制hTop2α活性)更可顯著抑制hTop2α。未來期望藉由單分子螢光共振能量轉移(single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer，smFRET)影像技術結合高靈敏性的TIRFM偵測系統尋找出化合物0785及其他化合物或藥物對hTop2α可能的作用干擾機制。