請用此 Handle URI 來引用此文件：
http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/7657完整後設資料紀錄
| DC 欄位 | 值 | 語言 |
|---|---|---|
| dc.contributor.advisor | 李佳音(Chia-Yin Lee) | |
| dc.contributor.author | Jia-Chi Gu | en |
| dc.contributor.author | 古家齊 | zh_TW |
| dc.date.accessioned | 2021-05-19T17:49:15Z | - |
| dc.date.available | 2027-08-20 | |
| dc.date.available | 2021-05-19T17:49:15Z | - |
| dc.date.copyright | 2017-09-04 | |
| dc.date.issued | 2017 | |
| dc.date.submitted | 2017-08-21 | |
| dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/7657 | - |
| dc.description.abstract | 小型核糖核酸在許多生理功能中扮演重要角色，其中之一的 RyhB 被廣泛研究，可透過與目標 mRNA 進行鹼基配對而調控基因表現，使細菌能快速適應周遭環境的變化，目前有關腸炎弧菌 RyhB 僅有少數的報導。本研究以臺灣分離之 Vibrio parahaemolytius no.93 作為實驗菌株，建構腸炎弧菌 ryhB 突變株與補償株，探討 ryhB 所參與調控之基因。弧菌屬與大腸桿菌 ryhB 序列比對顯示 RyhB 內部具高度廣泛保守區域以及弧菌屬保守區域。以 qRT-PCR 比較刪除 RyhB 部分保守區域之 ∆ryhB1 突變株與刪除 5’ 端之 ∆ryhB2 中 vp0106 和 sodB 基因表現，發現 RyhB cis- 調控目標之vp0106 在 ∆ryhB1 中大量表現，∆ryhB2 則相對野生株有相似或較低的表現量；RyhB trans- 調控目標 sodB 則在兩株 ryhB 突變株中皆大量表現。由 qRT-PCR 與 RNA-seq 分析基因轉錄表現，鐵離子相關的超氧歧化酶 sodB (VP2118)、琥珀酸去氫酶 sdhC (VP0843)，毒性相關的 T3SS1 調節子 toxS (VP0819) 受 RyhB 負調控而抑制其表現；RNA 聚合酶 σ 因子 rpoS (VP2553) 與未知功能基因 vp0106 受 RyhB 正調控而促進其表現。RNA-seq 結果顯示，野生株與 ∆ryhB2 突變株在缺鐵環境下會造成 864 個基因具 1.5 倍以上之差異表現，其中被 RyhB 抑制之基因為 648 個，GOG 分類主要為胺基酸轉運與代謝 (9.1%)、轉譯與核糖體結構與生合成 (6.6%)、轉錄 (5.3%)、無機離子轉運與代謝 (4.6%)、能量生成與轉換 (4.2%)、後轉譯修飾、蛋白質更新、伴護蛋白 (3.8%)、細胞壁 / 細胞膜 / 套膜生合成 (3.4%)；被 RyhB 促進 216 個基因，COG 分類主要為醣類轉運與代謝 (3.3%) 以及訊號傳遞機制 (3.1%)。RNAhybrid 線上程式的預測顯示 RyhB 保守區與目標 mRNA 的 5’ 非轉譯區具形成雙鏈體之潛在鹼基配對區。透過後轉錄螢光報導測試分析，顯示 RyhB 藉由保守區與 vp0106 進行鹼基配對而促進 vp0106 表現。本研究證實腸炎弧菌 RyhB 其高度廣泛保守區對於目標 mRNA 鹼基配對能力有最大影響。 | zh_TW |
| dc.description.abstract | Small RNA (sRNA) plays an important role in many physiological functions. One of the sRNA RyhB has been extensively studied and it could regulate gene expression by base pairing with the target mRNAs, allowing bacteria to rapidly adapt to changes in the surrounding environment. However, Vibrio parahaemolyticus RyhB has only a few reports. In this study, Vibrio parahaemolyticus no.93 isolated from Taiwan was used as the experimental strain to construct the mutant and the complemented strain to investigate ryhB involved in target genes regulation. The alignment of vibrios and E. coli ryhB sequences showed that RyhB had a highly-conserved region and a conserved region of vibrios. The expression of vp0106 and sodB in the ΔryhB1 mutant which RyhB partially conserved region was deleted and in the ΔryhB2 which 5' end of RyhB was deleted were observed by qRT-PCR. It was found that the RyhB cis-regulatory target vp0106 was numerously expressed in ΔryhB1, but in ΔryhB2 was relatively similar or lower than the wild-type strain. The RyhB trans-regulated target sodB was highly expressed in both ryhB mutants. The qRT-PCR and RNA-seq analysis demonstrated that iron-related superoxide dismutase sodB (VP2118), succinate dehydrogenase sdhC (VP0843), and the virulence-related T3SS1 regulator toxS (VP0819) were negatively regulated by RyhB. RNA polymerase σ factor rpoS (VP2553) and the unknown function gene vp0106 were positively regulated by RyhB. The RNA-seq results identified that wild-type strain and ΔryhB2 mutant would have 864 genes which were more than 1.5-fold differential expression in the iron-deficiency environment. Among these genes, 648 genes were inhibited by RyhB, and the GOG classification was mainly amino acid transport and metabolism (9.1%), translation, ribosomal structure and biosynthesis (6.6%), transcription (5.3%), inorganic ion transport and metabolism (4.6%), energy production and conversion (4.2%), post-translational modification, protein turnover, chaperones (3.8%), and cell wall/membrane/envelope biogenesis (3.4%). RyhB promoted the other 216 genes, and the COG classification was mainly carbohydrate transport and metabolism (3.3%) and signal transduction mechanisms (3.1%). The prediction of the RNAhybrid online program indicated that the RyhB conserved region and the 5’ untranslated region of the target mRNAs form a potential base-pairing region required for the formation of sRNA-mRNA duplex. Through the post-transcriptional fluorescent reporter assay displayed RyhB base-paired with vp0106 by a conserved region and promoted vp0106 expression. This study confirmed that the highly-conserved region of Vibrio parahaemolyticus RyhB had the greatest effect on the ability of base pairing with target mRNAs. | en |
| dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-05-19T17:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-106-R02623024-1.pdf: 44678286 bytes, checksum: ed7cbbc2c0dc542415e7f5e1938b3843 (MD5) Previous issue date: 2017 | en |
| dc.description.tableofcontents | 目錄
口試委員審定書 i 誌謝 ii 中文摘要 iv 英文摘要 v 表次 xi 圖次 xii 縮寫表 xiv 壹、前言 1 一、 腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 1 1. 性狀 1 2. 腸炎弧菌引起之疾病 3 3. 毒性因子 4 二、 鐵離子的調控 6 1. 鐵調控基因表現 6 2. 從宿主中獲得鐵 8 三、 小型核糖核酸 (Small RNA, sRNA) 9 1. 調節蛋白質活性的 sRNAs 10 2. sRNAs 在遠離目標 RNA 處轉錄 (反式編碼，coded in trans) 10 3. sRNAs在對應股中編碼以調節目標 RNA (順式編碼，coded in cis) 12 4. 5’ UTR元件 (5’ UTR Elements) 12 5. CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins) 系統 12 四、 RyhB 13 1. RyhB 的調控與研究 13 2. RyhB 在弧菌屬的研究 14 3. 以次世代定序新發現的 RyhB 目標顯示額外的角色和新的調控機制 15 五、 研究動機與目的 18 貳、實驗材料與方法 19 I. 實驗材料 19 一、實驗菌株、質體與引子 19 二、培養基 19 三、藥品與試劑 19 四、溶液與緩衝溶液 20 五、儀器設備 21 六、實驗使用套組 22 II. 實驗方法 23 一、DNA 技術 23 二、RNA技術 27 三、建構 ∆ryhB 突變株 29 四、建構補償株 30 五、南方墨漬法 (Southern Blot) 31 六、RNA 定序 (RNA-seq) 34 七、後轉錄報導載體測定 (Post-transcriptional reporter assay) 35 八、細菌生長曲線之測定 39 九、生物資訊分析 39 十、統計分析 40 參、實驗結果 42 一、 建構腸炎弧菌 no.93 之 ∆ryhB 突變株 42 二、 南方墨點法證實 ∆ryhB 突變株 43 三、 與實驗室先前刪除不同位置之腸炎弧菌 no.93 ∆ryhB 比較顯示 vp0106 調控上有所差異 43 四、 比較野生株與突變株生長速率 44 五、 可能受 RyhB 調控的目標基因互補序列預測 44 六、 以 qRT-PCR 觀察 RyhB 可能的目標基因在富鐵及低鐵最大表現時間點 46 七、 以 qRT-PCR 分析腸炎弧菌野生株與 ∆ryhB 突變株中可能受 RyhB 調控之基因表現量 47 八、 建構腸炎弧菌 no.93 之 ryhB 補償株及 ∆ryhB/p 菌株 47 九、 比較 WT/p、∆ryhB/p 及補償株 ∆ryhB/pryhB 菌株之生長曲線 48 十、 以 qRT-PCR 分析腸炎弧菌 WT/p、∆ryhB/p 與 ∆ryhB/pryhB中可能受 RyhB 調控之基因表現量 49 十一、 以 RNA-seq 分析腸炎弧菌 no.93 野生株與 ∆ryhB 突變株之轉錄體 50 十二、 以 RNA-seq 分析 WT 及 ∆ryhB 中具一點五倍以上差異表現之基因 COG 分佈 50 十三、 以 RNA-seq 分析 WT 及 ∆ryhB 菌株可能受 RyhB 調控之目標基因表現 52 十四、 以 RNA-seq 分析 WT 及 ∆ryhB 中超氧歧化酶家族基因表現量 53 十五、 以後轉錄報導測試分析 vp0106 主要受到 RyhB R2 鹼基配對促進表現 54 肆、討論 56 一、 與實驗室先前 ∆ryhB 突變株比較刪除 ryhB 部分對調控基因有所影響 56 二、 小型核糖核酸以鹼基配對進行調控之預測問題 57 三、 腸炎弧菌轉錄體之分析 58 四、 錳-超氧歧化酶 sodA 可能受 RyhB 調控而銅鋅-超氧歧化酶則無 59 伍、結論 60 陸、未來展望 61 柒、參考文獻 62 表次 表一、本研究中所使用之菌株 83 表二、本研究中所使用之質體 86 表三、本研究中所使用之引子 88 表四、腸炎弧菌 WT 及 ∆ryhB 於 TSB3 及含不同濃度 Dip 之 TSB3 培養基中生長情形 96 表五、腸炎弧菌 WT/p、∆ryhB/p 及 ∆ryhB/pryhB 於 TSB3 及含 0.1 mM Dip 之 TSB3 培養基中生長情形 97 表六、RNA-seq 定序與基因比對總結 98 表七、RNA-seq 中差異表現基因的 COG 在染色體上之百分比分佈 101 表八 、RNA-seq 中差異表現具 10 倍以上之基因 103 表九、RNA-seq 中差異表現具 5~10 倍之基因 105 表十、以 RNA-seq 分析 WT 及 ∆ryhB 菌株中 RyhB 潛在調控基因表現量 109 表十一、以 RNA-seq 分析 WT 及 ∆ryhB 菌株中超氧歧化酶家族基因表現量 112 圖次 圖一、腸炎弧菌 ryhB 鄰近基因和引子位置與建構 ryhB 刪除突變株示意 114 圖二、經由聚合酶鏈鎖反應與基因定序結果確認 ryhB 突變株之序列 115 圖三、南方墨點法證實 ryhB 突變株 116 圖四、以 qRT-PCR 分析可能受 RyhB 調控之標的基因 vp0106、sodB 在低鐵環境 WT 與兩株 ∆ryhB 突變株於各個時間點下之比較 118 圖五、腸炎弧菌 WT、∆ryhB 菌株於不同鐵離子濃度生長速率 119 圖六、弧菌屬與大腸桿菌中 RyhB 序列比較 120 圖七、 RyhB 預測折疊二級結構和保守區域 R1、R2 與 R3 之示意圖 121 圖八、鐵離子相關基因上游序列圖譜與 ryhB 可能鹼基配對之區域 123 圖九、毒性相關基因上游序列圖譜與 ryhB 可能鹼基配對之區域 126 圖十、移動性相關基因上游序列圖譜與 ryhB 可能鹼基配對之區域 129 圖十一、趨化性、壓力相關與未知功能基因上游序列圖譜與 ryhB 可能鹼基配對之區域 131 圖十二、以 qRT-PCR 分析可能受 RyhB 調控之目標基因 vp0106 表現時間點 132 圖十三、以 qRT-PCR 分析可能受 RyhB 調控之目標基因表現時間點 135 圖十四、以 qRT-PCR 分析 WT 及 ∆ryhB 菌株中 RyhB 潛在調控基因表現量 136 圖十五、以酵素截切質體確認腸炎弧菌補償株 ∆ryhB/pryhB 及 ∆ryhB/p 138 圖十六、腸炎弧菌 WT/p、∆ryhB/p 及 ∆ryhB/pryhB 菌株於不同鐵離子濃度生長速率 139 圖十七、以 qRT-PCR 分析 WT/p、∆ryhB/p 及 ∆ryhB/pryhB 菌株中不同基因表現量 141 圖十八、以 RNA-seq 分析 WT 及 ∆ryhB 菌株中具 1.5 倍以上差異表現之基因 COG 分佈 145 圖十九、以 qRT-PCR 與 RNA-seq 比較 WT 及 ∆ryhB 菌株中 RyhB 潛在調控基因的表現量 148 圖二十、以 qRT-PCR 確認 RNA-seq 分析結果 149 圖二十一、腸炎弧菌後轉錄報導測試雙質體示意圖 150 圖二十二、綠色螢光蛋白報導控制組質體 pRK416 示意圖 151 圖二十三、觀察不同時間點下 GFP 的表現與空載體背景值 152 圖二十四、綠色螢光蛋白報導表現質體 pRK420-target 示意圖 153 圖二十五、小型 RNA 表現控制組質體 pBAD34 示意圖 154 圖二十六、小型 RNA 表現質體 pBAD34-sRNA 示意圖 155 圖二十七、以 RT-PCR 分析阿拉伯糖 (arabinose) 誘導 RyhB 之表現 156 圖二十八、RyhB 對目標 mRNA 的調控 157 | |
| dc.language.iso | zh-TW | |
| dc.title | 腸炎弧菌小型核糖核酸 RyhB 的調控目標 | zh_TW |
| dc.title | Regulatory targets of small RNA RyhB in Vibrio parahaemolyticus | en |
| dc.type | Thesis | |
| dc.date.schoolyear | 105-2 | |
| dc.description.degree | 碩士 | |
| dc.contributor.oralexamcommittee | 楊翠青(Tsuey-Ching Yang),李宗夷(Tzong-Yi Lee) | |
| dc.subject.keyword | 腸炎弧菌,小型核糖核酸,次世代定序,鹼基配對, | zh_TW |
| dc.subject.keyword | Vibrio parahaemolyticus,sRNA,RyhB,RNA-seq,base-pairing, | en |
| dc.relation.page | 157 | |
| dc.identifier.doi | 10.6342/NTU201704126 | |
| dc.rights.note | 同意授權(全球公開) | |
| dc.date.accepted | 2017-08-21 | |
| dc.contributor.author-college | 生物資源暨農學院 | zh_TW |
| dc.contributor.author-dept | 農業化學研究所 | zh_TW |
| dc.date.embargo-lift | 2027-08-20 | - |
| 顯示於系所單位： | 農業化學系 | |
文件中的檔案：
| 檔案 | 大小 | 格式 | |
|---|---|---|---|
| ntu-106-1.pdf 此日期後於網路公開 2027-08-20 | 43.63 MB | Adobe PDF |
系統中的文件，除了特別指名其著作權條款之外，均受到著作權保護，並且保留所有的權利。